染料木素对阿尔茨海默病模型大鼠海马区神经递质含量的影响

李长兴 祁存芳 李建华 代冬芳 黄明玉 唐延军

(青海大学医学院人体解剖学教研室，青海 西宁 810001)

流行病学调查表明，阿尔茨海默病(AD)的发病与女性雌激素水平降低、缺乏有关〔1，2〕。临床试验表明，雌激素替代治疗可以改善AD患者的认知能力，但鉴于可能出现的严重副作用，人们开始关注具有雌激素效应、并能防止雌激素替代治疗出现的副作用的植物雌激素〔3〕。大豆异黄酮是从大豆中提取出来的具有弱雌激素样作用的异黄酮类化合物，其中染料木素是大豆异黄酮中作用最强的一种化学物质〔4，5〕。本研究试图通过观察雌激素去除后脑部海马区乙酰胆碱(Ach)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)及5-羟色胺(HT)递质含量的变化，及染料木素的干预作用，探讨染料木素影响学习记忆功能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选用12周龄健康雌性SD大鼠30只，体重180～200 g (兰州大学动物实验中心提供)。

1.2AD动物模型制备 β-淀粉样肽(Aβ)由美国Sigma公司提供。用生理盐水将Aβ1～40稀释成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其变为聚集状态的Aβ1～40。SD大鼠10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立体定位仪上，常规备皮消毒，切开头部皮肤，暴露硬脑膜。定位海马齿状回背侧细胞带(前囟后3.3 mm，旁开1.5 mm，颅骨表面下3.3 mm)。微量进样器自脑表面垂直进针，缓慢将Aβ1～401 μl(10 μg/μl)注入，注射速度为5 μl/h，留针0.5 h，使Aβ1～40充分浸润局部组织，缝合切口，常规饲养。

1.3动物分组和药物处理 随机分为假手术组(Sham)、卵巢切除组(Ovx)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0组(Ovx+Est)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0+染料木素1.0组(Ovx+Est+Gen1.0)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0+染料木素10.0组(Ovx+Est+Gen10.0)，每组6只。大鼠经氯胺酮腹腔注射麻醉后，摘除双侧卵巢；假手术组(Sham)手术过程与切除组相同，但不切除卵巢而只切除卵巢周围小块脂肪组织。隔日皮下注射给药21 d后取大鼠海马及子宫组织。Ovx+Est组给予1.0 mg/kg体重17β-雌二醇；Ovx+Est+Gen1.0组给予1.0 mg/kg体重的17β-雌二醇和1.0 mg/kg体重Gen；Ovx+Est+Gen10.0组给予1.0 mg/kg体重的17β-雌二醇和10.0 mg/kg体重Gen，上述药品溶媒均为芝麻油。Sham组、Ovx组每天给予等体积的芝麻油。

1.4Morris水迷宫测定 待Aβ1～40注射2 w后再测水迷宫潜伏期。即记录大鼠从入水到找到并爬上平台的时间，此时间称逃避潜伏期。每一时间段内4次潜伏期的算术平均数为这一时段的成绩进行统计分析。

1.5标本取材、神经递质含量和活性检测 实验各组药物处理21 d，麻醉后快速断头取脑迅速分离海马。同时分离大鼠的子宫并称重，作为观察雌激素作用的指标(子宫系数=子宫湿重/大鼠体重)。海马区Ach的测定采用酶联免疫法；5-HT，NE，DA的测定采用高效液相(HPLC)测定。

2 结 果

2.1大鼠子宫湿重测定结果 与Sham组比较，Ovx组子宫重量明显降低(P<0.05)。与Ovx组比较，Ovx+Est组的子宫重量增加(P<0.05)；与Ovx+Est组相比，Ovx+Est+Gen1.0组子宫重量显著降低(P<0.05)，但Ovx+Est组与ovx+Est+Gen10.0组之间无显著性差异(P>0.05)。表1。

2.2Morris水迷宫结果 与Sham组相比，Ovx组AD大鼠的水迷宫逃避潜伏期明显增长(P<0.01)；Ovx+Est组AD大鼠的水迷宫逃避潜伏期与Ovx组相比明显缩短(P<0.01)；与Ovx+Est组相比，Ovx+Est+Gen1.0组AD大鼠的水迷宫逃避潜伏期明显增长；Ovx+Est+Gen10.0组AD大鼠的水迷宫逃避潜伏期缩短，但与Ovx+Est组相比无统计学意义。见表2。

表1 AD模型大鼠子宫重量与子宫系数比较±s)

表2 AD模型大鼠逃避潜伏期比较±s)

2.3神经递质含量测定 与Sham组相比，Ovx组神经递质含量均降低；Ovx+Est组与Ovx组相比，Ovx+Est组神经递质含量明显增加(P<0.01)，与Ovx+Est组相比，Ovx+Est+Gen1.0组神经递质含量均降低；Ovx+Est+Gen10.0组与Ovx+Est组相比无统计学意义。见表3。

表3 AD模型大鼠海马区神经递质含量测定±s,n=6)

3 讨 论

流行病学调查表明，AD的发病有明显的性别差异，绝经后妇女的发病率较同龄男性高1.5～3.2倍〔6〕。这可能是老年妇女由于雌激素缺乏而使患AD的危险性增加，即与丧失了雌激素的保护作用有关〔7，8〕。而男性可继续产生睾酮，后者在脑内的P450芳香化酶的作用下转变成雌激素〔9〕。临床试验表明，绝经妇女接受雌激素治疗可降低AD发病的危险性，推迟AD的发病时间。但长期使用雌激素可增加子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌的发病率，限制了它的应用。鉴于雌激素替代治疗可能出现的严重副作用，人们开始关注具有雌激素效应、并能防止雌激素替代治疗出现副作用的植物雌激素。研究发现，从大豆、三叶草、葛根等植物中提取出来的具有雌激素活性的异黄酮类化合物，具有双重效应，在较低剂量时与雌激素竞争产生抗雌激素作用，而在较高剂量时可激活因雌激素不足而未能激活的ER，产生雌激素样作用〔10〕。

本研究结果显示，低剂量染料木素和雌激素同时处理时，可以降低海马区Ach、5-HT、NE、DA的含量，拮抗雌激素的上调作用，同时低剂量染料木素处理组逃避潜伏周期大于单纯雌激素处理组。这可能与以下机制有关：低剂量染料木素可能发挥雌激素拮抗作用，增加胆碱能M和N受体的结合位点的数目，促进Ach与胆碱能受体的结合；促进突触前膜对高亲和力胆碱的摄取；增加5-HT受体浓度；干扰DA受体介导的神经细胞钙通道改变引起的钙内流，影响AD大鼠学习记忆功能；大剂量染料木素和雌激素同时处理时，作用与单独给予雌激素作用相似，可能是通过模拟雌激素而发挥作用〔11，12〕。

综上所述，植物雌激素染料木素对AD大鼠具有神经保护作用，可提高认知功能；其作为植物雌激素，在制药、营养保健品等领域具有广泛的应用前景。

4 参考文献

1贾 安.阿尔茨海默病的雌激素替代治疗进展〔J〕.中国医师进修杂志，2008；31(24)：73-5.

2张文众，李 宁，李 蓉.大豆异黄酮的雌激素样作用研究〔J〕.卫生研究，2008；37(6)：707-9.

3Yokooji T，Kawabe Y，Mori N，etal.Effect of genistein，a natural soy isoflavone，on the pharmacokinetics and intestinal toxicity of irinotecan hydrochloride in rats〔J〕.J Pharm Pharmacol，2013；65(2)：280-91.

4杨期东，周 琳.中国阿尔茨海默病的流行病学特征〔J〕.中国临床康复，2004；8(31)：6982-3.

5Bieber EJ，Cohen DP.Estrogens and hormone replacement therapy：Is there a role in the preservation of cognitive function?〔J〕.Intern J Fertil Womens Med，2001；46(4)：206-9.

6Henderson V W，Benke K S，Green R C，etal.The protective effect of estrogen on Alzheimer's disease risk is associated with age〔J〕.Neurobiol Aging，2002；231(1)：S290.

7陈秋生，洪新如，宋岩峰.芳香化酶、雌激素与雄性生殖〔J〕.中国男科学杂志，2008;22(7)：55-7.

8朱迪娜，王 磊，王思彤，等.植物雌激素的研究进展〔J〕.中草药，2012;43(7)：1422-9.

9陈 多，张 冉，吴春福，等.雌激素改善学习记忆的机制〔J〕.分子科学学报，2002；18(4)：230-4.

10闫 燕，李妍怡.植物雌激素对阿尔茨海默病的作用研究进展〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2010；8(3)：348-9.

11Kuwahara R，Kawaguchi S，Kohara Y，etal.Effects of estrogen-related endocrine disrupters on learning and memory in rats〔J〕.J Pharmacol Sci，2010；1121：223P.

12Zurkovsky L，Brown SL，Boyd SE，etal.Estrogen modulates learning in female rats by acting directly at distinct memory systems〔J〕.Neuroscience，2007;144(1)：26-37.