高糖对体外培养的视网膜Müller细胞增殖及细胞信号传导网络的影响

孙雅彬 王大广 宋 鄂 叶 飞 张 泳 孙雅敏 徐越超

(吉林大学第一医院眼科，吉林 长春 130021)

糖尿病性视网膜病变(DR)是正处在工作年龄的成年人失明的一个重要原因〔1,2〕。在视网膜中Müller细胞与葡萄糖的代谢关系极其密切，它可以优先摄取葡萄糖，通过糖原代谢、有氧及无氧糖酵解为内层其他细胞供能，并且Müller细胞的突起包绕在视网膜的神经元及血管周围，与视网膜神经细胞及视网膜血管发生多种功能的交互作用。在高糖等病理条件下，Müller细胞可以通过生理的和生物合成的变化，影响视网膜内层细胞的代谢活动，干扰视网膜神经细胞和血管的正常功能〔3～6〕。本文通过检测不同葡萄糖浓度培养的视网膜Müller细胞增殖情况，了解高糖对Müller细胞增殖的影响，并且通过PPA技术检测高糖与正常血糖浓度下Müller细胞中蛋白质的表达情况，分析差异表达的蛋白质，明确高糖培养的视网膜Müller细胞的蛋白质表达特征。

1 材料与方法

1.1化学药品 无血清DMEM加入葡萄糖(Fisher Scientific公司, 美国Fair Lawn))至终浓度为5，10， 25，50 mmol/L。

1.2大鼠视网膜Müller 细胞培养与鉴定 按照我们以往实验的方法进行大鼠视网膜Müller 细胞培养与鉴定〔7〕。

1.3细胞增殖 MTT法用以检测高糖引起的Müller 增殖。第三代Müller 细胞接种于96孔板，每空细胞数约为5×103，无血清DMEM内孵育24 h。更换为高糖条件液再次孵育72 h。 然后每孔加入5 mg/ml 的MTT 10 μl再次孵育3 h。去掉上清液，每孔加入100 μl DMSO，用ELx800(Bio-Tek Instruments公司，美国 Winooski)分光光度仪，波长570 nm测量每孔的光度值。

1.4Protein pathway array Müller 细胞(1×106) 于10 cm培养皿内无血清DMEM培养24 h。然后细胞更换培养液为50 mmol/L葡萄糖培养72 h。用1倍细胞裂解液(Cell Signaling Technology公司，美国Danvers),包含20 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L焦磷酸钠，1 mmol/L β-甘油磷酸钠，1 mmol/L Na3VO4和1 μg/ml亮抑蛋白酶肽，提取细胞总蛋白。 每个培养皿中加入300 μl裂解液，用细胞刮板刮除培养皿表面的单层细胞。细胞裂解产物超声裂解15 s，2次，14 000 r/min，4℃，离心30 min。BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce公司，美国Rockford)检测蛋白质浓度。按前文所描述〔8〕，进行PPA流程。

1.5信号传导网络分析 应用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，一种基于互联网的信号通路分析软件，进行蛋白质之间生物功能的关联性分析。 将PPA中检测到的表达有显著差异(P<0.05)的蛋白质输入IPA软件，进行经典信号传导通路的功能性分析。以IPA软件内已知文献中各基因或蛋白质的相互作用为基础，将所输入蛋白质之间的直接或间接的作用进行分析，并最终构建出新的信号通路。应用数据库内的基因功能性分析，还能够分析出所输入蛋白质与哪些已知疾病的最具有关联性，并且应用Fisher精确检验计算P值。蛋白质在分析结果中被表示为“节点”，每两个“节点”之间的关系由一条直线表示，每条直线至少有一篇参考文献支持。

2 结 果

2.1高糖刺激Müller 细胞增殖 孵育72 h后，Müller细胞的增长呈葡萄糖浓度依赖性(50 mmol/L葡萄糖浓度增殖最强)。

2.2高糖条件下Müller细胞中的差异表达蛋白 根据配对t检验(P<0.05)和倍数变化值(>1.5)结果，在这些表达的蛋白质中，有47种蛋白质在正常葡萄糖浓度和高糖两组间表达量有显著性差异。其中40种蛋白质在高糖条件下高表达，包括VEGF (10.58 倍)，XIAP (3.33 倍)，Cyclin E (9.02 倍)，Nkx-3.1(8.76 倍)，PDEF (6.03 倍)，TNF-α(5.70 倍)，NFκB p65(4.24 倍)，IL-1β (5.49 倍)，Cdk4(5.48 倍)，p-PKC-α/βⅡ(5.46 倍)，NFκB p50(5.21 倍)，Bax (5.01 倍)，p38 (4.96 倍)，cdk2 p34(4.14 倍)，p-PKC-α(4.02 倍)，Cyclin B1(3.95 倍)，Cdk6(3.73 倍)，Cdk2(3.64 倍)，p-PTEN(3.56 倍)，Cyclin D1(3.38 倍)，Cdc25B(3.29 倍)，PTEN(2.98 倍)，Cdc25C(2.90 倍)，HIF-1α(2.59 倍)，ERK(2.55 倍)，p-Stat3(2.41 倍)，HIF-3α(2.40 倍)，p27(2.35 倍)，Bcl-6(2.30 倍)，Bcl-xL(1.89 倍)，uPA(1.54 倍)和p-AKT(1.53 倍)；其中7种蛋白质在高糖条件下表达下调，包括 p-GSK-3a/β(-9.24 倍)，p-p53(-7.35)，Erα(-4.56 倍)，KAI1(-3.53 倍)和RIP(-2.36 倍)。基于IPA结果，这47种蛋白质参与了几条重要的信号传导通路，包括XIAP/Apoptosis信号通路(p-p53, NFκB p65, p38, Bax, NFκB p50, c-IAP2, TNF-α, Bak, XIAP)，PI3K/AKT 信号通路(p-p53, NFκB p65, p-Akt, p38, 14-3-3 β, Hsp90, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, PTEN)，ILK信号通路(VEGF, NFκB p65, p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, HIF-1α, NFκB p50, Cyclin D1, TNF-α, PTEN)，PTEN信号通路(NFκB p65, p-Akt, p-p38, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, Bcl-xL, PTEN)，细胞周期：G1/S 节点调控信号通路(p-p53, p-RB, Cyclin E, Cdk4, Cdk6, Cyclin D1, Cdc2 p34)，HIF-1α信号通路(VEGF, Epo, p-p53, p-Akt, p38, Hsp90, HIF-1α)，细胞周期：G2/M 节点调控信号通路(Cdc25B, p-p53, Cdc25C and Cyclin B1, 14-3-3 β)，HGF信号通路(p-Akt, p-p38, p-Stat3, Cyclin D1, Cdc2 p34)，糖尿病信号通路(NFκB p65, p-Akt, p38, NFκB p50, TNF-α)，NFκB 信号通路(NFκB p65, p-Akt, RIP, IL-1β, NFκB p50, TNF-α)，VEGF 信号通路(VEGF, p-Akt, p38, HIF-1α)，ERK/MAPK信号通路(p38, p-GSK-3α/β, p-Stat3)和胰岛素受体信号通路(p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, PTEN)。这些结果提示高糖可以引起 Müller 细胞中信号传导通路改变，这些改变共同促使Müller细胞存活和增殖。

2.3IPA软件构建出高糖培养的视网膜Müller细胞差异表达蛋白质关系图 将PPA结果所筛选的47种差异表达蛋白质输入IPA信号通路软件进行分析，构建出这些蛋白质之间的相互作用关系图(图1)。

图1 高糖诱导的Müller细胞中差异表达蛋白的信号网络关系

3 讨 论

在糖尿病患者眼内Müller细胞表现为胶质细胞增生，细胞数量增多〔9〕。神经胶质增生出现在血脑屏障破坏之后，这样就进一步加重了血管功能障碍。神经胶质增生可能是由氧化应激以及多元醇通道的激活引起，因为这些通道的药理激活抑制了胶质纤维酸性蛋白的上调。糖尿病患者以及动物模型的Müller细胞的数量都增加了并且Müller细胞也被激活了，这体现在胶质纤维酸性蛋白(GFAF)以及巢蛋白的表达上调〔10〕。

Müller细胞会释放血管生成因子以及神经元营养因子以保护视网膜免受高血糖症诱导应力并最终对DR的发病机制做出贡献。VEGF是从DR早期的Müller细胞中释放出来的〔11〕，并且通过局部增加血管的渗透性来提高灌注，同时抗血管生成的PEDF也减少了〔12〕。VEGF以及其他的分泌因子，如碱性成纤维细胞生长因子，也是神经营养的，而且它们可能会保护神经元免受高血糖诱发的氧化应激〔13〕。目前尚不清楚血管生成因子的作用是否支持糖尿病视网膜中的应力神经元或是增加闭塞血管的渗透性。慢性暴露于这些因子会导致一个两相的视网膜反应，而且增加的渗透性会促进应力因子的进一步渗透并最终释放更多的渗透因子从而形成一个有害的正回馈循环。这样就行成了糖尿病黄斑水肿，而且它是患有DR患者失明的一个主要原因〔14〕。在糖尿病患者以及动物模型的玻璃体以及视网膜中已经检测到VEGF〔15,16〕。此外，VEGF以及PEDF的眼内层能够对非增殖期DR向增殖期DR的转变做出预测〔14〕。同样地，对VEGF的抑制会阻止患有糖尿病动物的血视网膜屏障的衰退而且在临床上已经开始血管内皮生长因子抗体的作用来治疗糖尿病黄斑水肿以及增殖期DR〔17,18〕。

胶质激活可能会导致与DR进程相关的炎症。Müller细胞、小神经胶质细胞或者是渗透到视网膜的白细胞都可以分泌细胞因子〔19〕。活性氧以及晚期糖基化终末产物的受体都已经在Müller细胞上得到表达，而且它们对于DR的发病机制都是非常重要的，因为氨基胍治疗会抑制DR在动物模型的发展〔20〕。诱生型氮氧合酶的数量在糖尿病人类患者以及动物模型都增加了而且它和VEGF超表达一样都位于Müller细胞，而且它还可能与糖尿病中血视网膜屏障破坏有关〔21〕。

我们的实验结果清晰的显示，高糖可以刺激Müller细胞增殖，这种增殖作用是Müller细胞中几条重要的信号传导通路共同参与的结果，并且 PPA结果 和IPA 软件分析证实高糖影响了细胞内许多经典信号传导通路，包括 XIAP/凋亡信号通路，VEGF 信号通路和细胞循环调控通路等。这些信号传导通路的变化可以减少Müller 凋亡，促进细胞存活，为DR的发病机制研究提供新的依据。

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