猪尿中盐酸赛庚啶残留指示物研究

吴剑平， 张 鑫， 李丹妮， 严 凤， 周悦榕， 顾 欣

（上海市兽药饲料检测所，上海长宁 201103）

盐酸赛庚啶是一种H1受体拮抗药，在临床上主治皮肤瘙痒、荨麻疹、湿疹、过敏性和接触性皮炎、鼻炎、偏头痛、支气管哮喘等疾病（关保元等，2007；王雷等，2004）。盐酸赛庚啶用于畜禽养殖业可以促进动物生长，其具有抗5-羟色胺的作用，可抑制下丘脑的饱觉中枢而刺激食欲，增加体重。赛庚啶在动物体内的残留可对食用者的健康产生危害。

本试验通过动物实验，获得了实际饲喂含盐酸赛庚啶饲料的生猪尿液，并利用已建立的分析方法对其进行分析检测，获得猪尿中盐酸赛庚啶原药的残留情况。动物体内盐酸赛庚啶的主要代谢途径为葡萄糖醛酸修饰和芳香基团修饰（Xesús等，2009），因此对尿液进行葡萄糖醛酸酶和硫酸芳基酯酶酶解后进行测定，并通过与尿中原型药物残留量的比较得到其主要代谢产物的残留量情况，从而确定盐酸赛庚啶在猪尿中的残留指示物。

1 试验材料

1.1 仪器 超高效液相色谱串联质谱系统（Waters○RUPLC-TQ MS，Masslynx○R工作软件）；高速冷冻离心机 （Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；减压旋转蒸发仪（B-490，BUCHI）。

1.2 材料、药品与试剂 十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（Agilent○R SB-C18，3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；混合型离子交换SPE柱 （Waters○R MCX，60 mg 3cc）。盐酸赛庚啶标准品（Sigma，Lot：068k1565，98%）；盐酸二苯拉林标准品（Sigma，Lot：126 h3541，100%）；β-葡萄糖醛酸苷酶（Merk， 美国，85000 IU/mL）；芳基硫酸酯酶（Merk，美国，7500 IU/mL）。 高氯酸（分析纯）；甲酸（色谱纯）；乙腈（色谱纯，Merk）；甲醇（色谱纯，Merk）；氨水（分析纯）；去离子水（自制，电阻率>10 MΩ·cm）；高纯氮（上海佳杰特种气体公司，99.999%）；高纯氩（上海佳杰特种气体公司，99.999%）。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相A为0.1%甲酸；流动相B为0.1%甲酸-乙腈，优化色谱条件后的梯度程序见表1。柱温为40℃；流速为0.3 mL/min；进样量5 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱条件 电离模式：正离子电喷雾电离（ESI＋）；质谱检测模式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气流量：800 L/h；脱溶剂温度：500℃；孔流速：50 L/h；碰撞气（Ar）流速：0.25 mL/min。分析中以保留时间和离子对丰度比作为定性分析依据，经过实验优化后的质谱参数见表2，典型MRM图见图1b。

表2 监测离子对质谱参数

2.3 样品前处理 取5.00 g猪尿样品，其中加入 50 μL含 100 μg/L盐酸二苯拉林的标准工作溶液，用5%氨水调节pH至11.0，再以异丙醇为分散剂，三氯甲烷为萃取剂，在5 mL猪尿体系中加入2 mL三氯甲烷-异丙醇 （5∶3，V/V）混合提取液和0.75 g氯化钠，涡旋振荡5 min使其形成水－分散相－提取剂充分混匀的体系。静置后，4℃下8000 r/min高速离心5 min，吸取下层溶剂至离心管中50℃氮气吹干后，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈（80∶20，V/V）溶解后过滤，上机测定，空白样品和实际样品典型MRM图见图1a和图 1c。

图1 盐酸赛庚啶及盐酸二苯拉林MRM图

2.4 动物实验 选取15头100日龄健康生猪，分3组进行饲喂实验，其中A组为空白对照组，B组为低剂量实验组，C组为高剂量实验组，饲喂饲料除添加药物量不同外其他均相同，一天饲喂两次，分栏饲养，具体饲喂量如表3所示，一天分早晚两次进行尿液采集，当天将采集到的尿液进行3000 r/min高速离心，取上清液50 mL存于尿样管中，4℃保存待测。

表3 实验动物每头份饲喂量

2.5 分组给药实验结果 按2.4动物实验过程进行药物添加饲喂，采集尿样按2.1～2.3中检测方法进行分析测定，结果如图2所示。实验结果表明，在饲料中添加不同含量的盐酸赛庚啶对实验动物进行饲喂后，其尿液中的盐酸赛庚啶含量比空白对照组有显著提高，且与饲料中的添加含量呈正相关。

图2 分组给药实验结果

2.6 酶解反应条件优化 使用2.5实验中所采集第3天B1猪的尿样进行酶解条件优化，5 mL尿液中添加20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶，根据试剂说明书描述最优酶解pH=5.6，对反应温度进行优化。分别在35、45、55、65℃条件下酶解 1、2、4、6、8 h 后对盐酸赛庚啶含量进行测定，所得如图3所示。结果表明，在35℃条件下需要反应的时间较长，8 h仍未达到反应终点；在45℃和55℃时需要4 h可达到反应终点，65℃下只需2 h，但55℃和65℃下达到终点后盐酸赛庚啶含量有一定的下降趋势，可能是由于温度较高容易促使盐酸赛庚啶原型药物发生其他反应。因此，实验结果表明最优酶解条件为5 mL尿液中添加20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶，55 ℃下酶解4 h。

图3 酶解温度优化结果

2.7 非酶解和酶解后尿中盐酸赛庚啶含量的比较 对2.5中分组饲喂实验中所采集的尿样进行酶解，比较酶解后与酶解前所测得的猪尿中的盐酸赛庚啶含量，结果如图4所示。实验结果表明，猪尿中盐酸赛庚啶原型药物含量占主要代谢物种类中的绝大多数，可以作为猪尿中检测盐酸赛庚啶的残留指示物。

图4 非酶解和酶解结果比较

2.8 停止给药消除实验 在2.5分组给药饲喂实验结束后停止在B组和C组饲料中添加药物，然后，连续7 d进行采样，检测猪尿中盐酸赛庚啶残留量，结果如图5所示。实验结果表明，停止给药后猪尿中盐酸赛庚啶原型药物残留量有明显下降趋势，其中半衰期为2 d，6 d后完全消失。

图5 停药消除实验结果

3 结论

本实验结果表明，猪尿中盐酸赛庚啶主要以原型药物的形式存在。其含量与饲喂量呈正相关，半衰期为2 d，6 d后几乎完全消除。

[1]关保元，李建强，李淑云，等.盐酸赛庚啶治疗喘息性支气管炎50例疗效分析[J].中国冶金工业医学杂志，2007，24（8）：504.

[2]王雷，梁颖，杨新建，等.盐酸赛多平乳膏与盐酸赛庚啶乳膏对照治疗慢性神经性皮炎 75 例[J].中国新药杂志，2004，13（10）：938 ～ 939.

[3]Xesús F，Lei Y，Seyed V H，et al.Development and validation of LC-MS/MS method for the determination of cyproheptadine in several pharmaceutical syrup formulations[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，50：1044 ～ 1049.■