富硒枸杞子对临床常见分离耐药菌体外抑菌活性的研究＊

马 锐，杨风琴，刘俊文，万巧凤（．宁夏医科大学高等卫生职业技术学院，宁夏银川 750004；．宁夏医科大学检验学院，宁夏银川 750004）

目前，国内外科研机构竞相开展了关于枸杞化学成分分析、药理学、免疫学、抗疲劳、抗肿瘤等基础方面的研究［1－6］，为枸杞的开发利用提供了理论支持。尽管我国对宁夏枸杞进行了大量的研究，但对枸杞的临床耐药菌抗菌机制研究尚鲜见报道。本文以枸杞子为原料，制备不同浓度浸出液，研究其对6种常见临床分离耐药菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、克柔假丝酵母菌、白色念珠菌）的体外抑菌作用，并测定其最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），分析抑菌圈直径；并根据结果绘制出铜绿假单胞菌在提取液中的生长曲线，旨在更好地体现枸杞子的药用价值，同时也为枸杞子的全面开发、利用提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料来源

1．1．1 枸杞子 富硒枸杞子是宁夏南梁农场科技人员采用生物转化技术培养的富含有机硒与超氧化物歧化酶（SOD）活性的全天然营养性枸杞果实。

1．1．2 实验菌株 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌均由宁夏医科大学附属医院医学实验中心提供。

1．2 仪器与试剂

1．2．1 实验仪器 电热恒温培养箱（DNP－9162），杭州汇尔实验设备有限公司生产；生物安全柜BHC－1300ⅡA／B3，武汉爱斯佩科学仪器有限公司生产；全自动高压蒸汽灭菌器（YQXLS50A），青岛海亿特机电科技发展有限公司生产；电子天平（AL－203），上海精科天美仪器有限公司生产。

1．2．2 实验试剂 1 000μL加样器、10～50μL加样器、加样器枪头、无菌试管、直径75mm无菌培养皿。95%乙醇、无菌生理盐水均购自上海艾测电子专业销售有限公司。

1．3 研究方法

1．3．1 枸杞子浸出液的制备方法 称取全天然营养性枸杞果实100g，加水500mL，温度18～20℃，浸泡24h，文火煮沸0．5h后过滤。再将其沉渣加水400mL浸泡4h，煮沸0．5h后用细菌过滤器过滤。然后将两次的过滤液，混合加热浓缩至100mL，即为100%原液，其浓度相当于生药量1g／mL，－80℃保存。实验中再分别用蒸馏水稀释成0．75、0．50、0．25g／mL，同时，以蒸馏水作为空白对照组。

1．3．2 培养基的配制 水解酪蛋白液体培养基（批号OWDM0202）、水解酪蛋白琼脂培养基（批号20120726）、沙保罗氏固体培养基（批号20120921），上海江莱生物制品有限公司生产，使用时按使用说明配制。

1．3．3 菌悬液的配制 挑取冷冻菌种适量，接种于普通肉汤培养基试管中，28℃培养24h，用接种环挑取菌液在琼脂平板上划线，培养24h，挑取单个菌落接种于普通肉汤培养基培养16～18h。取出后用比浊仪测定菌液浓度，用无菌水制成含菌量混浊度为0．5McFarland（比浊标准为108CFU／mL），再将其稀释至107CFU／mL备用。

1．3．4 微量稀释法进行MIC的测定 将全天然营养性枸杞果实原液用无菌蒸馏水溶解，配制为1g／mL药液，用水解酪蛋白双料液体培养基从第1管进行倍比稀释至第7管，稀释倍数分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，各管对应的药物浓度分别是0．500、0．250、0．125g／mL。每管加相应受试标准菌液各50μL，充分混匀，放置于37℃培养箱培养18～24h。再从每一管中取培养物10μL，转种到水解酪蛋白琼脂培养基、沙保罗氏固体培养基上，用L棒涂布，置37℃培养箱培养18～24h，以不生长菌落的最高药物稀释度为该药物对该种细菌的MIC。做3次，取其平均值并记录实验结果。

1．3．5 MBC的测定 吸取全天然营养性枸杞不同浓度浸出液的MIC和高于MIC浓度的各个梯度的试管中的培养物0．1 mL，转接于营养琼脂培养基平板，37℃下培养18～24d后观察有无菌落形成，无菌落形成的相应试管中的最低药物浓度即为该浓度浸出液对供试菌的MBC。

1．3．6 琼脂扩散法 用无菌棉签蘸取菌液在普通琼脂平板上作均匀密集划线，待菌液干燥后，用外径5mm的打孔器打孔，每孔加药液200μL，平放在37℃温箱中培养24h观察结果，测量抑菌圈直径。抑菌圈直径取3次实验结果的平均值。

1．3．7 设立对照 阴性对照：培养基不加菌；阳性对照：培养基加相应的菌。

1．3．8 铜绿假单胞菌生长曲线的绘制 将铜绿假单胞菌培养至对数生长期，按2%的接种量加入到含0．25g／mL全天然营养性枸杞子的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入37℃、120r／min摇床培养，在0～52h中每4h取样一次，用可见分光光度计在波长为580nm下测定其吸光度值（A值），加入等量无水乙醇为对照组，实验重复3次，取平均值。绘制枸杞子作用于铜绿假单胞菌的生长曲线。

2 结 果

2．1 枸杞子浸出液对6种临床常见细菌的MIC和MBC 不同浓度的枸杞子浸出液对耐药菌均有一定程度抑菌效果，但对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的抑菌作用强；对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抑菌作用一般；而对克柔假丝酵母菌和白色念珠菌的相对较弱。结果见表1。

表1 枸杞子浸出液对6种临床常见细菌的MIC和MBC

2．2 不同浓度枸杞子浸出液对6种临床常见细菌的抑菌圈直径比较 采用稀释法对4种不同浓度枸杞子浸出液测定金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、克柔假丝酵母菌、白假丝酵母菌、铜绿假单胞菌的抑菌圈直径，随着浓度的增加，6种细菌的抑菌圈直径增加，其中铜绿假单胞菌的增加最明显而且抑菌圈直径最大；而白假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌在不同浓度下，抑菌圈直径增加不明显。结果见表2。

表2 不同浓度枸杞子浸出液对6种临床常见细菌的抑菌圈直径（±s，mm）

表2 不同浓度枸杞子浸出液对6种临床常见细菌的抑菌圈直径（±s，mm）

注：与0．25g／mL浓度比较，aP＜0．05；b P＜0．01。

组别 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 白假丝酵母菌 克柔假丝酵母菌空白对照000000枸杞子浸出液（g／mL）0．25 20．82±0．37 20．76±0．41 22．78±0．31 23．07±0．45 16．77±0．41 15．98±0．54 0．50 21．91±0．19 21．81±0．14 23．80±0．29a 24．16±0．49a 17．56±0．29 16．36±0．48 0．75 23．57±0．40a 23．39±0．44a 27．57±0．47b 29．34±0．39b 18．97±0．34 16．97±0．34 1．00 26．48±0．45b 26．36±0．39b 30．89±0．51b 35．16±0．34b 19．16±0．23a 17．86±0．44a

2．3 枸杞子对铜绿假单胞菌生长曲线的影响 宁夏全天然营养性枸杞子浸出液对铜绿假单胞菌生长曲线的影响结果见图1。由图可知，枸杞子组中的铜绿假单胞菌在对数生长期明显被抑制，8h的抑制率最高为77．41%。24h时细菌浓度最高，但A值为2．245，比对照组小4%，随即二者均进入衰亡期，从图中可以看出，在28h之前，枸杞子提取物严重地抑制了铜绿假单胞菌的生长。

图1 枸杞子对铜绿假单胞菌生长曲线的影响

3 讨 论

伴随分子生物学、生物化学和免疫学新技术的发展，许多研究者对于祖国传统中医中药的研发力度在逐步加强。宁夏回族自治区中宁县是全国枸杞的最好产地，宁夏地区食物中的含硒量极低，而通过生物技术培育的富硒枸杞，其抗氧化清除自由基的作用得到了强化［7－8］。本研究初筛的枸杞抗菌活性物质是未知成分，其生物学性状未知，只能根据相关研究资料来设计实验方案。预期经过一步步实验得到比较理想的抗菌肽活性物质，为枸杞抗菌肽药效、药理学和抑菌机制的研究奠定了理论基础。

近年来，由于抗菌药物的广泛应用，耐药菌株逐年增多，据统计对青霉素G耐药的金黄色葡萄球菌已达90%以上，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）已成为医院内感染最常见的致病菌［9－11］。本文通过测定不同枸杞子浸出液对耐药菌的MIC、MBC和测量抑菌圈直径发现，不同枸杞子浸出液对耐药菌均有一定程度抑菌效果，其中对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的抑菌作用强，而对葡萄球菌的抑菌作用一般，对白色假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌的抑菌作用相对较弱。初步分析，由于革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁成分、结构不同，枸杞子对于革兰阴性菌的抑制作用明显好于革兰阳性菌［12］，这对临床治疗选择合适的抗生素带来了便利。

在医源性感染中由铜绿假单胞菌引起者占10%左右，在某些特殊病房中，如烧伤和肿瘤病房、各种导管和内镜的治疗与检查室内，铜绿假单胞菌的感染率可高达30%。同时，铜绿假单胞菌对许多抗生素具有天然或获得性耐药性，甚至多重耐药，给临床治疗带来极大困难。而本研究通过测量MIC、MBC和抑菌圈直径发现枸杞子浸出液对铜绿假单胞菌的抑菌作用强，故绘制出铜绿假单胞菌在提取液中的生长曲线，希望能为研究枸杞子作为抗铜绿假单胞菌新药提供了基础理论依据。同时，充分利用枸杞资源，获得抗菌活性成分，有利于宁夏枸杞的生产，进而有利于发展本地经济，增加产区人们的经济收入，同时减少抗生素的大量使用，保护环境。

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