高效液相色谱法测定谷氨酰胺的含量

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摘 要：建立高效液相色谱法测定谷氨酰胺含量的方法。色谱柱为氨基柱，流动相为：0.05 mol/L的磷酸二氢钾（取磷酸二氢钾6.8 g，加水至1000 ml，用磷酸调节pH值为4.0）∶乙腈=70∶30，检测波长为215 nm，结果表明该方法在所试验的浓度范围内具有良好的线性关系，r为0.999，精密度RSD等于0.37%，平均回收率为98.3%。

关键词：谷氨酰胺 高效液相色谱法 测定

中图分类号：R927 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）05（b）-0240-02

谷氨酰胺（Glutamin）亦被称作麸酰胺酸，为人体中含量最丰富的非必需氨基酸。临床上主要用于改善胃溃疡和十二指肠溃疡的症状。常见的分析方法有毛细管电泳法[1]。本文建立了通过高效液相色谱法测定谷氨酰胺的方法，实验证明该方法操作简便、专一性及灵敏度高，结果准确可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器

HLPC色谱仪型号：LC-20A，色谱仪编号：L20134506488AE，分析天平型号：AE100 分析天平编号：LS012，超声波型号：AS3120A，检测波长：λ=215 nm。

1.2 色谱条件

检测器型号：SPD-20A，检测器灵敏度：2.0AUFS柱温：35 ℃，进样体积：20 ul流速：1.0 ml/min，流动相：0.05 moL/L的磷酸二氢钾（取磷酸二氢钾6.8 g，加水至1000 ml，用磷酸调节PH值为4.0）∶乙腈=70∶30，色谱柱：NH￠4.6×250 mm，色谱柱号：312316。

1.3 材料与试剂

乙腈（色谱纯，康科德公司），磷酸二氢钾（AR级），磷酸（AR级），谷氨酰胺对照品（山东宝齡生物技术有限公司），高纯水。

1.4 样品制备

标准溶液的制备：精密称取谷氨酰胺标准品250 mg于50 ml容量瓶中，用纯化水稀释并定容至刻度，摇匀，再精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，备用。其浓度为1 mg/ml。

样品溶液的制备：称取本品约250 mg，精密称定于50 ml容量瓶中，用纯化水稀释并定容至刻度，摇匀，再精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，备用。其浓度为1 mg/ml。

1.5 测定方法

分别取标准品溶液和供试品溶液盛装于2 ml自动进样瓶中，进行自动进样（进样量为20 ul），注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中谷氨酰胺的含量。

2 实验结果

2.1 系统适用性试验

在上述色谱条件下，取标准溶液进行自动进样，连续进样6针，谷氨酰胺峰与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5；理论板数、拖尾因子，6次色谱峰峰面积的相对标准偏差（RSD）、六次色谱峰的保留时间分别为：9.80、9.79、9.79、9.78、9.70、9.71，其相对标准偏差RSD=1.2%，小于2.0%；6次色谱峰面积分别为：1205488、10665、1200380、1204391、1170905、1186594，其相对标准偏差标准偏差（RSD）为1.2%小于5%；拖尾因子分别为：1.2、1.2、1.3、1.4、1.4、1.4，其相对标准偏差标准偏差（RSD）为0.7%均小于2%；理论塔板数分别为：4886、4867、5001、5185、5545、5867，均大于4000。

2.2 线性

用对照品制备不同浓度的样品，使其浓度分别为0.5 mg/ml、0.75 mg/ml、1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml。每个浓度连续进样3针。以检测得到的峰面积平均值、浓度作线性回归，其线性回归方程为y=1188457x，其中y为峰面积，x为谷氨酰胺浓度（见图1），线性相关系数R2为0.999。结果表明在目标浓度0.5 mg/ml～1.5 mg/ml内，该方法具有良好的线性关系。

2.3 准确度

分别制备浓度约为1 mg/ml的对照品溶液和浓度约为1 mg/ml的样品溶液。分别吸取样品溶液1 ml和标准溶液0.8 ml；样品溶液1 ml和标准溶液1.0 ml；样品溶液1 ml和标准溶液1.2 ml分别加入10 ml容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，制备浓度分别为80%、100%、120%的三种浓度的混合溶液。每个浓度连续进样三针，记录实验结果。实验结果表明该方法在三个浓度下其回收率分别为99.5%、97.6%、97.9%。平均回收率达到98.3%，表明该测定方法具有较高的检测准确度。

2.4 精密度

称取标准品约250 mg，精密称定于50 ml容量瓶中，用纯化水稀释并定容至刻度，摇匀，作为贮备液备用。再分别加标准贮备溶液0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，制成浓度分别为80%、100%、120%的三种浓度，备用。每个浓度连续进样三针，记录色谱图。实验结果表明三个实验下其相对标准偏差RSD分别为0.47%、0.42%、0.20%，平均相对标准偏差RSD=0.37%。该结果表明该方法重现性较好。

2.5 专一性

从图2可以看出，用该方法可以较好的分离测定谷氨酰胺的相关物质如谷氨酸、焦谷氨酸等，具有专一性高的特点。

3 讨论

本文建立的高效液相色谱法测定谷氨酰胺含量的方法，其检测波长为215nm，流动相为0.05 mol/L的磷酸二氢钾（用磷酸调节PH值为4.0）∶乙腈=70∶30，实验结果表明该方法在其线性范围内具有专一性高，检测结果准确的特点。

参考文献

[1] 吴建，邓留杰，郭利芬，等.毛细管电泳法检测转化液中谷氨酰胺和谷氨酸[J].食品科学，2008，29（4）.endprint