不同发酵温度对开菲尔产氨基酸及理化性质的影响

摘要：开菲尔中除含有多种益生菌外，在发酵过程中还可代谢产生多种功能性物质。试验研究了开菲尔在不同发酵温度下游离氨基酸变化、活性益生菌增殖及对乳酸合成水平的影响，结果表明，30 ℃发酵至终点，pH值为4.60，开菲尔中游离氨基酸水平高达576.2 mg/kg，活菌数达1.6×1011 CFU/g，乳酸合成量为8.0 g/L，表现出极好的功能性成分产生水平、菌体细胞生长活性和酸化能力。

关键词：开菲尔；氨基酸；发酵温度；活菌数；乳酸

中图分类号： TS252.42文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0236-03

收稿日期：2013-11-21

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（编号：2012BAD28B07、2013BAD18B01）。

作者简介：王豪（1984—），男，上海人，硕士，工程师，主要从事乳品生物技术研究。E-mail：wanghao840818@126.com。发酵乳是通过乳酸菌等菌种，代谢利用乳中乳糖和蛋白质等成分，产生多种生物活性物质，赋予机体极好的营养价值及益生特效的一种产品[1]。乳酸菌是一类对营养物质选择较为挑剔的微生物，在多数情况下此类菌群的生物合成能力有限，需要外源的氨基酸或肽来支持其生长代谢。由于生乳中缺乏此类小分子物质，因此，乳酸菌的生长取决于对酪蛋白的水解能力[2]。酪蛋白是氨基酸的主要来源，其水解与乳酸菌所分泌的蛋白酶密切相关，细胞膜上的蛋白酶是唯一能够催化酪蛋白降解为低聚肽的关键酶，然后，低聚肽才能被转入膜内，再经由内肽酶及氨肽酶等进一步降解。发酵乳中由乳酸菌代谢释放积累的氨基酸会显著影响发酵乳制品的营养功能，而游离氨基酸的种类及产生水平取决于乳的品类、乳酸菌的组成、发酵参数和贮存条件等因素。发酵乳中氨基酸总量反映蛋白水解及菌体细胞同化之间的平衡关系，例如，保加利亚乳杆菌的蛋白水解活性要强于嗜热链球菌，前者产生的氨基酸为后者同化利用，从而建立了一种菌群共生平衡关系。

开菲尔是一种由混合菌群发酵制成的乳制品，目前少有文献报道开菲尔发酵过程中体系内游离氨基酸的变化。本试验研究开菲尔菌群在不同发酵温度下氨基酸释放利用、细胞生长及乳酸产生的特性，以揭示开菲尔菌株间的互生关系，从而在未来工业化生产中可以设计出具有高活菌数、高含量游离氨基酸的发酵乳，提升产品的营养价值和益生功效。

1材料与方法

1.1材料与试剂

生鲜牛乳，光明乳品八厂生产；白砂糖，广西上上糖业有限公司生产；开菲尔复合发酵剂，含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种，丹尼斯克公司生产；氨基酸化学分析试剂包，美国 Waters 公司生产；Pico Taq衍生化试剂盒，美国Waters公司生产；超滤膜，美国Millpore公司生产；MRS培养基、M17培养基，德国Merck公司生产；其他均为国产分析纯试剂。

1.2仪器与设备

超净工作台，美国Labconco公司生产；厌氧培养箱，英国Ruskinn公司生产；电热恒温水槽，上海精宏实验设备公司生产；高压灭菌锅，日本Hirayama公司生产；高速冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER公司生产；HPLC色谱仪，美国 Waters 公司生产；pH计，美国奥立龙公司生产。

1.3试验方法

1.3.1开菲尔制备生牛乳验收→净化→混料（白砂糖，40～45 ℃）→均质（60～65 ℃，19～21MPa）→杀菌（90 ℃，5 min）→冷却→接种发酵至pH值4.6±0.02→搅拌破乳→冷却至16～22 ℃→灌装封口。

1.3.2氨基酸测定样品用4%磺基水杨酸沉淀，4 ℃、10 000 g 离心20 min；取上清液，用10 000 NMWL的膜超滤，等分为50 L，采用Pico Taq衍生化试剂盒进行衍生反应，用于HPLC上样分析；采用氨基酸化学分析试剂包对游离氨基酸的异硫氰酸苯酯衍生物进行定量。色谱分析条件：Pico Taq柱（3.9 mm×30 cm），温度46 ℃，进样量10 L（取自 100 L 稀释的衍生化样品）；标准品为额外添加了色氨酸和天冬酰胺的H级氨基酸，进样量为25 pmol。

1.3.3乳酸测定参考Boehringer描述的酶法检测流程[3]。

1.3.4微生物计数采用无菌去离子水进行梯度系列稀释，平行试验3次。乳球菌及链球菌计数使用M17琼脂培养基，乳杆菌计数使用MRS琼脂培养基，均采用倾注平板法，分别在30、37、42 ℃环境温度下培养至形成明显菌落后进行计数。活菌计数以1 g中的菌落集成单位（CFU/g）来表示。

2结果与分析

2.1不同发酵温度下开菲尔的活菌数含量及乳酸合成量

由图1可见，开菲尔菌群中无论是杆菌还是球菌，在 30 ℃ 培养时前6 h内均呈指数级态势生长，此发酵温度处于乳酸乳球菌最适的生长温度范围，低于保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适生长温度，促使整个发酵过程中球菌数均高于杆菌数；发酵17 h后，pH值降至酪蛋白等电点4.61时，球菌数较杆菌数高出约1个数量级，总菌数达1.6×1011 CFU/g，所合成的乳酸总量达8.0 g/L。在发酵过程中，虽然球菌和杆菌均表现出很好的细胞生长趋势及酸化活性，但是均未到达典型的稳定期。

2.2不同发酵温度下开菲尔的氨基酸产生种类及合成量endprint

摘要：开菲尔中除含有多种益生菌外，在发酵过程中还可代谢产生多种功能性物质。试验研究了开菲尔在不同发酵温度下游离氨基酸变化、活性益生菌增殖及对乳酸合成水平的影响，结果表明，30 ℃发酵至终点，pH值为4.60，开菲尔中游离氨基酸水平高达576.2 mg/kg，活菌数达1.6×1011 CFU/g，乳酸合成量为8.0 g/L，表现出极好的功能性成分产生水平、菌体细胞生长活性和酸化能力。

关键词：开菲尔；氨基酸；发酵温度；活菌数；乳酸

中图分类号： TS252.42文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0236-03

收稿日期：2013-11-21

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（编号：2012BAD28B07、2013BAD18B01）。

作者简介：王豪（1984—），男，上海人，硕士，工程师，主要从事乳品生物技术研究。E-mail：wanghao840818@126.com。发酵乳是通过乳酸菌等菌种，代谢利用乳中乳糖和蛋白质等成分，产生多种生物活性物质，赋予机体极好的营养价值及益生特效的一种产品[1]。乳酸菌是一类对营养物质选择较为挑剔的微生物，在多数情况下此类菌群的生物合成能力有限，需要外源的氨基酸或肽来支持其生长代谢。由于生乳中缺乏此类小分子物质，因此，乳酸菌的生长取决于对酪蛋白的水解能力[2]。酪蛋白是氨基酸的主要来源，其水解与乳酸菌所分泌的蛋白酶密切相关，细胞膜上的蛋白酶是唯一能够催化酪蛋白降解为低聚肽的关键酶，然后，低聚肽才能被转入膜内，再经由内肽酶及氨肽酶等进一步降解。发酵乳中由乳酸菌代谢释放积累的氨基酸会显著影响发酵乳制品的营养功能，而游离氨基酸的种类及产生水平取决于乳的品类、乳酸菌的组成、发酵参数和贮存条件等因素。发酵乳中氨基酸总量反映蛋白水解及菌体细胞同化之间的平衡关系，例如，保加利亚乳杆菌的蛋白水解活性要强于嗜热链球菌，前者产生的氨基酸为后者同化利用，从而建立了一种菌群共生平衡关系。

开菲尔是一种由混合菌群发酵制成的乳制品，目前少有文献报道开菲尔发酵过程中体系内游离氨基酸的变化。本试验研究开菲尔菌群在不同发酵温度下氨基酸释放利用、细胞生长及乳酸产生的特性，以揭示开菲尔菌株间的互生关系，从而在未来工业化生产中可以设计出具有高活菌数、高含量游离氨基酸的发酵乳，提升产品的营养价值和益生功效。

1材料与方法

1.1材料与试剂

生鲜牛乳，光明乳品八厂生产；白砂糖，广西上上糖业有限公司生产；开菲尔复合发酵剂，含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种，丹尼斯克公司生产；氨基酸化学分析试剂包，美国 Waters 公司生产；Pico Taq衍生化试剂盒，美国Waters公司生产；超滤膜，美国Millpore公司生产；MRS培养基、M17培养基，德国Merck公司生产；其他均为国产分析纯试剂。

1.2仪器与设备

超净工作台，美国Labconco公司生产；厌氧培养箱，英国Ruskinn公司生产；电热恒温水槽，上海精宏实验设备公司生产；高压灭菌锅，日本Hirayama公司生产；高速冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER公司生产；HPLC色谱仪，美国 Waters 公司生产；pH计，美国奥立龙公司生产。

1.3试验方法

1.3.1开菲尔制备生牛乳验收→净化→混料（白砂糖，40～45 ℃）→均质（60～65 ℃，19～21MPa）→杀菌（90 ℃，5 min）→冷却→接种发酵至pH值4.6±0.02→搅拌破乳→冷却至16～22 ℃→灌装封口。

1.3.2氨基酸测定样品用4%磺基水杨酸沉淀，4 ℃、10 000 g 离心20 min；取上清液，用10 000 NMWL的膜超滤，等分为50 L，采用Pico Taq衍生化试剂盒进行衍生反应，用于HPLC上样分析；采用氨基酸化学分析试剂包对游离氨基酸的异硫氰酸苯酯衍生物进行定量。色谱分析条件：Pico Taq柱（3.9 mm×30 cm），温度46 ℃，进样量10 L（取自 100 L 稀释的衍生化样品）；标准品为额外添加了色氨酸和天冬酰胺的H级氨基酸，进样量为25 pmol。

1.3.3乳酸测定参考Boehringer描述的酶法检测流程[3]。

1.3.4微生物计数采用无菌去离子水进行梯度系列稀释，平行试验3次。乳球菌及链球菌计数使用M17琼脂培养基，乳杆菌计数使用MRS琼脂培养基，均采用倾注平板法，分别在30、37、42 ℃环境温度下培养至形成明显菌落后进行计数。活菌计数以1 g中的菌落集成单位（CFU/g）来表示。

2结果与分析

2.1不同发酵温度下开菲尔的活菌数含量及乳酸合成量

由图1可见，开菲尔菌群中无论是杆菌还是球菌，在 30 ℃ 培养时前6 h内均呈指数级态势生长，此发酵温度处于乳酸乳球菌最适的生长温度范围，低于保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适生长温度，促使整个发酵过程中球菌数均高于杆菌数；发酵17 h后，pH值降至酪蛋白等电点4.61时，球菌数较杆菌数高出约1个数量级，总菌数达1.6×1011 CFU/g，所合成的乳酸总量达8.0 g/L。在发酵过程中，虽然球菌和杆菌均表现出很好的细胞生长趋势及酸化活性，但是均未到达典型的稳定期。

2.2不同发酵温度下开菲尔的氨基酸产生种类及合成量endprint

摘要：开菲尔中除含有多种益生菌外，在发酵过程中还可代谢产生多种功能性物质。试验研究了开菲尔在不同发酵温度下游离氨基酸变化、活性益生菌增殖及对乳酸合成水平的影响，结果表明，30 ℃发酵至终点，pH值为4.60，开菲尔中游离氨基酸水平高达576.2 mg/kg，活菌数达1.6×1011 CFU/g，乳酸合成量为8.0 g/L，表现出极好的功能性成分产生水平、菌体细胞生长活性和酸化能力。

关键词：开菲尔；氨基酸；发酵温度；活菌数；乳酸

中图分类号： TS252.42文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0236-03

收稿日期：2013-11-21

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（编号：2012BAD28B07、2013BAD18B01）。

作者简介：王豪（1984—），男，上海人，硕士，工程师，主要从事乳品生物技术研究。E-mail：wanghao840818@126.com。发酵乳是通过乳酸菌等菌种，代谢利用乳中乳糖和蛋白质等成分，产生多种生物活性物质，赋予机体极好的营养价值及益生特效的一种产品[1]。乳酸菌是一类对营养物质选择较为挑剔的微生物，在多数情况下此类菌群的生物合成能力有限，需要外源的氨基酸或肽来支持其生长代谢。由于生乳中缺乏此类小分子物质，因此，乳酸菌的生长取决于对酪蛋白的水解能力[2]。酪蛋白是氨基酸的主要来源，其水解与乳酸菌所分泌的蛋白酶密切相关，细胞膜上的蛋白酶是唯一能够催化酪蛋白降解为低聚肽的关键酶，然后，低聚肽才能被转入膜内，再经由内肽酶及氨肽酶等进一步降解。发酵乳中由乳酸菌代谢释放积累的氨基酸会显著影响发酵乳制品的营养功能，而游离氨基酸的种类及产生水平取决于乳的品类、乳酸菌的组成、发酵参数和贮存条件等因素。发酵乳中氨基酸总量反映蛋白水解及菌体细胞同化之间的平衡关系，例如，保加利亚乳杆菌的蛋白水解活性要强于嗜热链球菌，前者产生的氨基酸为后者同化利用，从而建立了一种菌群共生平衡关系。

开菲尔是一种由混合菌群发酵制成的乳制品，目前少有文献报道开菲尔发酵过程中体系内游离氨基酸的变化。本试验研究开菲尔菌群在不同发酵温度下氨基酸释放利用、细胞生长及乳酸产生的特性，以揭示开菲尔菌株间的互生关系，从而在未来工业化生产中可以设计出具有高活菌数、高含量游离氨基酸的发酵乳，提升产品的营养价值和益生功效。

1材料与方法

1.1材料与试剂

生鲜牛乳，光明乳品八厂生产；白砂糖，广西上上糖业有限公司生产；开菲尔复合发酵剂，含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种，丹尼斯克公司生产；氨基酸化学分析试剂包，美国 Waters 公司生产；Pico Taq衍生化试剂盒，美国Waters公司生产；超滤膜，美国Millpore公司生产；MRS培养基、M17培养基，德国Merck公司生产；其他均为国产分析纯试剂。

1.2仪器与设备

超净工作台，美国Labconco公司生产；厌氧培养箱，英国Ruskinn公司生产；电热恒温水槽，上海精宏实验设备公司生产；高压灭菌锅，日本Hirayama公司生产；高速冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER公司生产；HPLC色谱仪，美国 Waters 公司生产；pH计，美国奥立龙公司生产。

1.3试验方法

1.3.1开菲尔制备生牛乳验收→净化→混料（白砂糖，40～45 ℃）→均质（60～65 ℃，19～21MPa）→杀菌（90 ℃，5 min）→冷却→接种发酵至pH值4.6±0.02→搅拌破乳→冷却至16～22 ℃→灌装封口。

1.3.2氨基酸测定样品用4%磺基水杨酸沉淀，4 ℃、10 000 g 离心20 min；取上清液，用10 000 NMWL的膜超滤，等分为50 L，采用Pico Taq衍生化试剂盒进行衍生反应，用于HPLC上样分析；采用氨基酸化学分析试剂包对游离氨基酸的异硫氰酸苯酯衍生物进行定量。色谱分析条件：Pico Taq柱（3.9 mm×30 cm），温度46 ℃，进样量10 L（取自 100 L 稀释的衍生化样品）；标准品为额外添加了色氨酸和天冬酰胺的H级氨基酸，进样量为25 pmol。

1.3.3乳酸测定参考Boehringer描述的酶法检测流程[3]。

1.3.4微生物计数采用无菌去离子水进行梯度系列稀释，平行试验3次。乳球菌及链球菌计数使用M17琼脂培养基，乳杆菌计数使用MRS琼脂培养基，均采用倾注平板法，分别在30、37、42 ℃环境温度下培养至形成明显菌落后进行计数。活菌计数以1 g中的菌落集成单位（CFU/g）来表示。

2结果与分析

2.1不同发酵温度下开菲尔的活菌数含量及乳酸合成量

由图1可见，开菲尔菌群中无论是杆菌还是球菌，在 30 ℃ 培养时前6 h内均呈指数级态势生长，此发酵温度处于乳酸乳球菌最适的生长温度范围，低于保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适生长温度，促使整个发酵过程中球菌数均高于杆菌数；发酵17 h后，pH值降至酪蛋白等电点4.61时，球菌数较杆菌数高出约1个数量级，总菌数达1.6×1011 CFU/g，所合成的乳酸总量达8.0 g/L。在发酵过程中，虽然球菌和杆菌均表现出很好的细胞生长趋势及酸化活性，但是均未到达典型的稳定期。

2.2不同发酵温度下开菲尔的氨基酸产生种类及合成量endprint