宫颈病变组织中Vimentin、P16INK4A、Smad4的定位、表达及其在EMT中的作用

韩淑珍，熊 晖，王小英，陈小毅，王 森

(1广东医学院附属厚街医院，广东东莞523900;2广东医学院病理学教研室;3广东医学院肿瘤研究所)

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，在导致妇女死亡的恶性肿瘤中占第二位，人乳头瘤病毒(HPV)感染是子宫颈癌的首要病因。P16INK4A/Rb是HPV致癌作用的两大重要途径之一，P16INK4A基因在大部分恶性肿瘤中表达缺失，但在宫颈癌中表现为过表达，在宫颈癌中的具体作用尚不明确。P16INK4A高表达对宫颈癌上皮—间质转化(EMT)有何影响目前尚无研究报道。我们观察了Vimentin、P16INK4A和Smad4在宫颈癌及前期病变中的定位与表达水平，探讨其对宫颈癌细胞EMT的影响和可能机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年2月～2013年4月广东医学院附属厚街医院妇产科门诊宫颈活检病例共120例，其中慢性子宫颈炎、低级别宫颈上皮内瘤变(CIN)、高级别CIN和宫颈癌各30例。患者年龄16～78岁，中位年龄36岁。标本经4%中性甲醛固定，常规切片，分别做HE和免疫组织化学染色。CIN和宫颈癌病例术前均未接受放化疗和其他针对肿瘤的治疗，所有病例在厚街医院病理科确认并复审。

1.2 主要试剂 APES购于福州迈新有限公司，PV-6000免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、小鼠抗人单克隆抗体Vimentin(克隆号V9，批号18J1779A)和P16INK4A(克隆号G175-405)购于DAKO公司，小鼠抗人单克隆抗体Smad4(sc-7966)购自Santa Cruz有限公司。

1.3 Vimentin、P16INK4A和Smad4检测方法 免疫组织化学染色按照PV-6000试剂盒说明书进行，采用0.01 mol/L柠檬酸缓冲液进行高压抗原修复，Smad4抗体工作浓度为1∶200，其余抗体为工作液。实验中以已知阳性组织为阳性对照、PBS代替一抗作为空白对照。由两人分别独立对实验结果进行双盲法评估。光镜观察Vimentin、P16INK4A和Smad4在宫颈病变组织中的表达定位。400×光镜下计数至少400个肿瘤细胞，结果判断:①按阳性细胞百分率计分:无阳性表达肿瘤细胞计0分;阳性细胞≤25%计1分;26%～50%计2分;≥51%计3分。②按染色强弱计分:无染色计0分;淡黄色计1分;黄色计2分;棕黄色计3分。两项相乘，评分0分为阴性，1～4分为阳性，6～9分为强阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS14.0统计软件。计数资料比较用χ2检验，两变量间的相关性检验采用Spearman等级相关分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Vimentin、P16INK4A和 Smad4在宫颈病变组织中的定位 Vimentin、P16INK4A和Smad4在各宫颈病变组织中呈不同程度阳性表达，在细胞质和细胞核均可表达。见图1。

图1 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宫颈病变组织中的表达(×200)

2.2 Vimentin、P16INK4A和 Smad4在宫颈病变组织中的表达水平 见表1。

表1 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宫颈病变组织中的阳性表达率(%)

2.3 宫颈病变组织中 Vimentin、P16INK4A和 Smad4表达与临床病理参数的关系 Vimentin在慢性子宫颈炎、低级别CIN、高级别CIN和宫颈癌组织细胞质和细胞核中的表达差异均有统计学意义(P均＜0.01)。P16INK4A在慢性子宫颈炎组织细胞质和细胞核中表达为阴性，在低级别CIN、高级别CIN和宫颈癌组织细胞质和细胞核中表达水平均增加(P均＜0.01)。Smad4在慢性子宫颈炎组织中细胞核与细胞质均为高表达，细胞核中Smad4在低级别CIN、高级别CIN和宫颈癌组织中表达水平降低(P均＜0.01);Smad4在4者细胞质中的表达差异无统计学意义。Spearman相关分析显示，120例宫颈病变组织中Smad4核表达与P16INK4A的核质表达均呈负相关(r分别为 -0.274、-0.387，P 均 ＜0.01)，Smad4核表达与Vimentin核表达亦呈负相关(r=-0.209，P＜0.05)，P16INK4A核质表达与Vimentin核表达均呈正相关(r分别为0.334、0.443，P 均 ＜0.01)。宫颈癌组织中Vimentin、P16INK4A和Smad4无论细胞核表达或细胞质表达均与宫颈癌的分化和年龄无相关关系(P均＞0.05)。见表2。

表2 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宫颈病变组织中的表达定位与临床病理参数的关系(%)

3 讨论

EMT在肿瘤侵袭和转移过程中发挥着重要作用。有研究［1］表明宫颈癌中存在着EMT，E-cadherin表达减少和Vimentin表达增高是宫颈癌浸润进展的重要指标［2］。本实验结果显示，随着宫颈病变程度的增加，Vimentin表达水平不断增加;宫颈癌、高级别CIN组织Vimentin表达水平高于低级别CIN与慢性子宫颈炎组织，与其他学者的结果一致。本实验中Vimentin在细胞核中表达高于细胞质的表达，Spearman相关分析显示Vimentin核表达与病变组织学类型相关，提示Vimentin核表达在宫颈癌的浸润进展中起主要作用，这一结果与我们在鼻咽癌EMT 中的研究［3］相似。

P16INK4A是细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)抑制因子，在大部分恶性肿瘤中表达缺失，但在宫颈癌中P16INK4A表现为过表达。有学者［4］认为P16INK4A在宫颈癌中高表达仅仅是HPV抑制Rb负反馈调节P16INK4A的结果。目前国内外无P16INK4A高表达对宫颈癌直接影响及机制的文献报道。最近，Burd等［5］用萤光素酶基因敲入小鼠模型P16(LUC)观察发现，在肿瘤形成和间质细胞围绕时P16INK4A的激活非常明显，提示P16INK4A的激活是肿瘤形成的一种特征。已有文献［6～10］报道，在某些肿瘤中，P16INK4A作为β-catenin、RhoC等的靶基因参与EMT的调控，P16INK4A过表达与Twist1启动子过甲基化存在相关性，这些研究结果都间接提示P16INK4A在肿瘤的发生、发展中发挥作用。我们的研究发现，P16INK4A高表达的其中一个原因可能是P16 exon1在宫颈癌组织中扩增产物的拷贝数较癌旁正常组织明显增加而引起［11］。本实验中免疫组化结果显示，P16INK4A不仅在CIN及宫颈癌组织的细胞质高表达，在细胞核中亦高表达，且P16INK4A与Vimentin核表达呈正相关，P16INK4A在CIN和宫颈癌组织中的表达明显高于慢性子宫颈炎组织，提示P16INK4A参与宫颈癌EMT并发挥重要作用。

Smad4是肿瘤抑制基因DPC4的产物，在多种肿瘤中都有表达。TGF-β/Smad信号传导通路在肿瘤中具有重要地位，但Smad在宫颈癌进展中的具体定位和作用尚不清楚。本实验观察发现，Smad4蛋白在慢性子宫颈炎组织中细胞核与细胞质均为高表达，Smad4细胞质表达水平在不同宫颈病变中无明显差异，细胞核中Smad4在低级别CIN、高级别CIN和宫颈癌组织中表达逐渐降低，表达定位结果与张琰等［12］报道相似。本实验中Smad4核表达与Vimentin核表达呈负相关关系，提示进入细胞核的Smad4表达下降可能是引起宫颈癌细胞EMT的原因之一，与薜慧婷等［13］报道低表达 Smad4可抑制SMMC-7721肝癌细胞EMT的结果相反。Smad4核表达降低使TGF-β诱导的细胞生长抑制反应性减弱，可能促进肿瘤的生长和恶性转化［14～16］，宫颈癌患者无病生存期缩短及5年总生存率下降［17］。国外研究报道［18］抑制Cdk4/6可诱导胰腺癌细胞出现EMT，并增加胰腺癌细胞的侵袭和转移能力，是通过Smad依赖的TGF-β途径进行。我们前期研究［19］通过免疫共沉淀和Western blot分析发现，宫颈癌中过度表达的P16INK4A仍然具有结合Cdk4的能力。结合本实验Spearman相关分析结果，120例宫颈病变组织中Smad4核表达与P16INK4A核质表达均呈负相关，提示P16INK4A可能通过结合Cdk4并抑制其活性，协同或影响Smad4核表达参与宫颈癌发生EMT，其效应途径有待进一步通过分子生物学研究证实。

综上所述，Vimentin核表达增强是诊断宫颈癌细胞EMT的有效指标。P16INK4A高表达和Smad4核表达下降参与了宫颈癌细胞 EMT。进一步研究P16INK4A高表达在宫颈癌中调控的分子机制，有利于探讨宫颈癌细胞EMT的形成，为宫颈癌治疗性疫苗的新靶点研制提供理论基础和实验依据。

［1］Koay MH，Crook M，Stewart CJ.Cyclin D1，E-cadherin and betacatenin expression in FIGO Stage IA cervical squamous carcinoma:diagnostic value and evidence for epithelial-mesenchymal transition［J］.Histopathology，2012，61(6):1125-1133.

［2］Myong NH.Loss of E-cadherin and acquisition of Vimentin in epithelial-mesenchymal transition are noble indicators of uterine cervix cancer progression ［J］.Korean J Pathol，2012，46(4):341-348.

［3］Luo W，Fang W，Li S，et al.Aberrant expression of nuclear vimentin and related epithelial-mesenchymal transition markers in nasopharyngeal carcinoma［J］.Int J Cancer，2012，131(8):1863-1873.

［4］Kanao H，Enomoto T，Ueda Y，et al.Correlation between p14(ARF)/p16(INK4A)expression and HPV infection in uterine cervical cancer［J］.Cancer Lett，2004，213(1):31-37.

［5］Burd CE，Sorrentino JA，Clark KS，et al.Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model［J］.Cell，2013，152(1-2):340-351.

［6］Delmas V，Beermann F，Martinozzi S，et al.Beta-catenin induces immortalization of melanocytes by suppressing p16INK4aexpression and cooperates with N-Ras in melanoma development［J］.Genes Dev，2007，21(22):2923-2935.

［7］ Wang Z，Banerjee S，Ahmad A，et al.Activated K-ras and INK4a/Arf deficiency cooperate during the development of pancreatic cancer by activation of Notch and NF-κB signaling pathways［J］.PLoS One，2011，6(6):e20537.

［8］Xie S，Zhu M，Lv G，et al.The role of RhoC in the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells［J］.Med Oncol，2012，29(3):1802-1809.

［9］ Fischer AN，Fuchs E，Mikula M，et al.PDGF essentially links TGF-beta signaling to nuclear beta-catenin accumulation in hepatocellular carcinoma progression ［J］.Oncogene，2007，26(23):3395-3405.

［10］Missaoui N，Hmissa S，Trabelsi A，et al.Promoter hypermethylation of CDH13，DAPK1 and TWIST1 genes in precancerous and cancerous lesions of the uterine cervix ［J］.Pathol Res Pract，2011，207(1):37-42.

［11］郑晓娟，胡新荣，唐泽立，等.p16与eIF4E在宫颈癌中基因改变情况的初步研究［J］.实用癌症杂志，2011，26(1):13-15.

［12］张琰，曹旭，江明，等.Smad4在白血病细胞中表达的初步研究［J］.中国实验血液学杂志，2006，14(4):210-212.

［13］薜慧婷，王宏刚，黄晓丹，等.低表达Smad4对肝癌细胞SMMC-7721上皮间质转化的影响［J］.世界华人消化杂志，2012，20(11):923-929.

［14］张競，李胜泽.TGF-β1及Smad4蛋白在子宫颈癌组织中的表达及其意义［J］.实用癌症杂志，2008，23(5):465-468.

［15］Zhang B，Halder SK，Kashikar ND，et al.Antimetastatic role of Smad4 signaling in colorectal cancer［J］.Gastroenterology，2010，138(3):969-980.

［16］李巧稚，阿提开姆·阿布都克热木，王燕，等.子宫颈癌中Smad4和Runx3表达与HPV16感染的关系［J］.临床与实验病理学杂志，2012，28(10):1112-1115.

［17］Kloth JN，Kenter GG，Spijker HS，et al.Expression of Smad2 and Smad4 in cervical cancer:absent nuclear Smad4 expression correlates with poor survival［J］.Mod Pathol，2008，21(7):866-875.

［18］Liu F，Korc M.Cdk4/6 inhibition induces epithelial-mesenchymal transition and enhances invasiveness in pancreatic cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2012，11(10):2138-2148.

［19］庞天云，邓飞，郑晓娟，等.抑癌基因蛋白p16在宫颈癌中过度表达对其结合Cdk4功能的影响［J］.广东医学，2011，32(1):50-53.