高效液相色谱法测定血清卡马西平的优化方案

肖润梅，郭珍立，孙敬智，陈 勇

(1湖北大学生命科学院湖北省生物技术省重点实验室，武汉430062;2湖北省新华医院)

卡马西平(Carbamazepine，CBZ)作为亚氨基二苯乙烯衍生物，是目前儿科临床最常用的抗癫痫药(Antiepileptic drugs，AEDs)之一，更是治疗单纯及复杂部分性发作的首选药物［2］。由于其血药浓度范围窄，且存在明显的个体差异，易发生不良反应［3］。为了提高临床用药的有效性和安全性，减少不良反应，需要对治疗药物卡马西平进行监测。用高效液相色谱法测定血清抗癫痫类药物的方法学研究已被广泛报道［4］，但对实验方法中样品前处理各种因素的选择较少报道。2013年2～5月，我们探讨建立以高效液相色谱法测定人血清CBZ浓度的实验方法优化方案。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 Waters 2695-2998高效液相色谱仪(配光电二极管阵列检测器，美国Waters公司)，KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DK-450B型电热恒温水槽(上海深信实验仪器有限公司)，HP-01系列溶剂过滤器、OHAUS万分之一电子天平(德国Sartorious公司)，TDL80-2B型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，XK96-B快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司)。本实验中所用试剂除另有说明外均为分析纯试剂，水为去离子水。甲醇(色谱纯 J.T.Baker)，CBZ对照品(批号:100142-201105)，苯巴比妥对照品(批号:171222-200605)，苯妥英钠对照品(批号:100210-201002)均购于中国药品生物制品检定所。乙酸乙酯(批号:T20110629)，乙醚(批号:20110412)均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的建立 色谱柱:Hypersil C18(200 mm ×4.6 mm，10 μm);采用梯度洗脱方式;二极管阵列检测波长;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量:10 μL。

1.2.2 血清预处理方法 采集患者血液后37℃水浴30 min，2 000 r/min速度离心4 min，放置4℃冰箱冷藏待用［5］。

1.2.3 样品预处理优化选择 ①萃取溶剂的选择:考察了乙醚、乙酸乙酯2种萃取剂对 CBZ的影响［6］，取0.2 mL 上清液分别与乙醚、乙酸乙酯各600 μL混合涡旋2 min，以3 500 r/min速度离心4 min，水浴中挥发至干，用1.0 mL流动相溶解残留物，10 000 r/min离心20 min后进样分析［7］。②样品与萃取剂比例的选择:取0.2 mL样品上清液分别与0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 乙酸乙酯混合提取，考察不同体积比的样品与萃取剂对萃取效率的影响。③萃取时间的选择:将样品与萃取剂混合后涡旋萃取，萃取时间选择 3、6、9、12 min，考察不同萃取时间对萃取效率的影响。

1.2.4 工作曲线的绘制 CBZ标准储备液:准确称取CBZ对照品，用甲醇定容。配制成CBZ(2.468、4.937、7.406、9.875、12.344、24.688 μg/mL)标准液系列［8］，按样品处理方法进行处理后，以外标法进行定量测定［9］。

1.2.5 检出限计算方法 将高效液相色谱仪调节至最佳测定状态，按研制的测定方法连续7次测定接近空白浓度的溶液，由测定值计算浓度平均值和标准差，以3倍的标准差所对应的浓度为检出限［10］。

1.2.6 准确度和精密度计算方法 将血清样品分成4组，一组为空白组值，其余三组经样品处理后分别加入高、中、低3个浓度的标准溶液，每组6个样品。测定后取平均值，减去空白组值，计算准确度和精密度［11］。

2 结果

2.1 流动相及洗脱程序 CBZ在梯度洗脱中流动相比例甲醇∶水 =61.3∶38.7，7.9 min 时出峰，其标准和样品色谱图见图1、2。

图1 CBZ标准品色谱图

图2 CBZ样品色谱图

2.2 样品预处理的优化条件

2.2.1 萃取溶剂 乙酸乙酯提取样品中CBZ的浓度为7.071 μg/mL，乙醚提取样品中CBZ的浓度为9.674 μg/mL。

2.2.2 样品与萃取剂体积比 不同体积比的样品与萃取剂对萃取效率的影响见图3。

图3 样品与萃取剂比例的选择

2.2.3 萃取时间 萃取3、6、9、12 min时测得药物浓度分别为 24.0、22.2、25.0、19.1 μg/mL。结果表明血清药物浓度随萃取时间的增加变化不大，萃取时间选择为3 min。

2.2.4 标准曲线 测定组分CBZ的标准曲线见图4。线性方程为 Y=3.79e+0.03X-8.80e+0.03，线性范围为1.52～48.8 mg/L，线性关系良好，相关系数为0.999 1，可满足测定需要。

2.2.5 检出限 测得血清中CBZ的最低检出浓度为0.4 mg/L。

2.2.6 准确度和精密度 血清中CBZ的准确度和精密度结果见表1。

图4 CBZ标准曲线

表1 血清中CBZ的准确度和精密度

3 讨论

流动相及洗脱程序的确定中CBZ的出峰时间在甲醇浓度为50%以后，保留时间较集中。由于梯度洗脱平衡柱子需要的时间长［12］，且实验室考虑与做其他药物血药浓度测定的流动相比较相似，为了简化液相流动相平衡的时间和实验室便于记忆，所以将卡马西平的流动相确定为甲醇∶水=60∶40的等度洗脱方式。二极管阵列检测波长在210～400 nm，检测波长为254 nm。

萃取溶剂的选择中乙酸乙酯提取率/乙醚提取率为73.09%。实验选择乙酸乙酯做萃取剂主要基于以下几点原因:①乙醚的低沸点易挥发特性使得用乙醚萃取的时候很难定量，实验使用乙醚时为了定量必须萃取4次才能把血清中的药物提取干净。而用乙酸乙酯做萃取剂时容易定量，只需要提取1次，简化了实验。②水浴挥发乙酸乙酯将水浴温度提高到75℃时，得到的产物与标准物质比对，其保留时间没有改变，同时也没有新物质生成。将水浴温度56℃与75℃挥发所得产物浓度比较，没有显著性差别。说明提高水浴温度对药物性质和浓度没有影响，克服了乙酸乙酯沸点高、挥发时间长的缺点。③乙酸乙酯对CBZ的提取率虽然比乙醚低，但是乙酸乙酯的的提取率/乙醚的提取率也达到73.09%，可以满足临床血药浓度检测的需要，因此实验选择乙酸乙酯做萃取剂。

萃取溶剂用量过少时，目标组分不能被充分萃入有机相，而溶剂用量过多时，则会导致样品被稀释，并延长挥发萃取液的时间［13］。考察了不同体积比的样品(200 μL)与萃取剂对萃取效率的影响。综合考虑组分的低、高浓度的萃取效率，选择样品与萃取剂的体积比为1∶3。高浓度的萃取浓度明显随着溶剂的增加增大，但是当样品与萃取剂体积比例为1∶5时萃取浓度反而降低，分析是由于实验使用1.5 mL的 EP 管，受到体积的限制，样品(200 μL)与萃取剂比例为1∶5时(总体积为1.2 mL)的涡旋提取率明显降低。

本文成功建立了以高效液相色谱法测定人血清CBZ浓度的优化方案，确定了最佳样品预处理条件，优化了色谱分离及检测条件，提高了检测灵敏度。所建立的高效液相色谱法具有灵敏、准确、快速等特点，能够满足临床治疗中药物浓度监测工作的要求。

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