聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的修饰条件优化

贺晓强，范 开，，蔡晓娜，刘立平，陈 清

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054;2.重庆富进生物医药有限公司，重庆 400041)

促胰岛素分泌肽(glucogan-like peptide-1，GLP-1)是一种主要由肠道L细胞分泌，由30个氨基酸残基组成的肽类激素。由于其相对分子质量小，在体内容易被二肽基肽酶-IV降解和被循环系统清除，且具有免疫原性和抗原性，因此在临床应用上受到限制［1-3］。

聚乙二醇化(polyethylene glycol，PEG)修饰可起到延长药物半衰期、降低药物的免疫原性和抗原性、减少循环系统清除速率的作用。随着PEG修饰技术的发展，定点修饰已经成为趋势，而修饰剂马来酰亚胺活化单甲氧基聚乙二醇(PEG Maleimide，mPEG-mal)就是最常用的修饰剂之一［4-6］。

艾塞那肽(商品名为Byetta)是含39个氨基酸的人工合成的多肽，它和天然的GLP-1有53%的同源性，都可以与GLP-1受体结合并激活，且不会被体内二肽基肽酶-IV降解，延长了半衰期［7-10］。Byetta(39肽)的氨基酸序列为HGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。 将Byetta最后一个氨基酸丝氨酸替换成一个半胱氨酸C(简称ByC39)，利用化学合成法合成，氨基酸序列为HGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC;然后用 mPEG-mal-40 kDa对ByC39进行定点修饰。根据文献［11-12］，mPEG-mal-40 kDa在pH值为6.0～7.0的修饰缓冲体系中能特异地偶联在蛋白或者多肽游离巯基上。因此，本文通过研究修饰pH值、修饰缓冲体系，以及修饰保护剂，对修饰条件进行优化。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

原料:马来酰亚胺活化单甲氧基聚乙二醇，相对分子质量为40 kDa(mPEG-mal-40kDa)，采购于北京键凯科技有限公司;ByC39多肽委托成都凯捷生物医药科技发展有限公司化学合成，纯度都在98%以上。

主要试剂:乙酸(CH3COOH)，乙酸钠(CH3COONa)，三(2-羧乙基)膦(TCEP)，乙二胺四乙酸(EDTA)，赖氨酸(Lys)，均购于上海生工生物工程技术有限公司。

主要仪器:AKTA Basic100纯化仪，美国 GE公司;岛津LC-15C型高效液相色谱，日本岛津;SP Sepharose F.F阳离子纯化填料，Source 15RPC填料，美国 GE公司;Agilent 1120-LC-MS，德国 Agilent公司;实验用水均采用Rios超纯水系统处理。

1.2 试验方法

1.2.1 修饰pH

ByC39多肽通过SP阳离子层析柱回收后，用pH 值为6.0、6.5、7.0 的 50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH缓冲液稀释3份终浓度为1.0 mg/mL的样品，按照ByC39多肽与mPEG-mal-40kDa修饰剂反应摩尔比为1∶3的比例加入 mPEG-mal-40kDa修饰剂，25℃反应4 h，用RP-HPLC分析修饰率和SDS-PAGE检测。

1.2.2 修饰缓冲体系

ByC39多肽通过SP阳离子层析柱回收后，用pH值为6.5的50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH、50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲剂分别稀释样品至1.0 mg/mL，按照ByC39多肽与mPEG-mal-40kDa修饰剂反应摩尔比为1∶3的比例加入mPEG-mal-40kDa修饰剂，25℃反应 4 h，用 RPHPLC分析修饰产物。

1.2.3 修饰保护剂

ByC39多肽通过SP阳离子层析柱回收后，取同样 2份，用 pH值为6.5的 50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH缓冲稀释样品浓度至1.0 mg/mL。按照ByC39多肽与mPEG-mal-40kDa修饰剂反应摩尔比为1∶3的比例加入mPEG-mal-40kDa修饰剂，其中一个同时补入终浓度为2.0 mmol/L的Lys和5.0 mmol/L EDTA，另外一个不加任何试剂做对照。25℃反应4 h后，用TFA将pH值调为3.0，终止反应，取样进行RP-HPLC分析。

2 实验结果

2.1 SDS-PAGE和RP-HPLC检测结果

1)SDS-PAGE检测不同修饰pH值(6.0～7.0)对修饰率的影响，结果如图1所示。

图1 不同修饰pH值(6.0～7.0)凝胶电泳图

2)RP-HPLC检测不同修饰pH值(6.0～7.0)对修饰率的影响，如图2～4所示。

图2 pH=6.0时修饰结果

图3 pH=6.5时修饰结果

在 pH值为6.0、6.5、7.0时修饰率分别为70%、95%、76%。前期研究发现PEG-ByC39在高pH值缓冲条件下蛋白性质不太稳定，从提高修饰率、增加PEG-ByC39的稳定性考虑，选择pH值为6.5作为修饰条件，这样既能达到高修饰率，又能保持蛋白的稳定性质。

图4 pH=7.0时修饰结果

2.2 RP-HPLC检测2种缓冲体系对ByC39与mPEG-mal-40kDa修饰结合率的影响

经RP-HPLC分析(见图5)，pH值为6.5的CH3COONa-CH3COOH缓冲体系和NaH2PO4-Na2HPO4缓冲体系对修饰效率影响非常小，说明蛋白在这2种缓冲中都很稳定。但是PEG-ByC39的前期稳定性研究表明其在醋酸盐缓冲最为稳定，因此选择 pH值为6.5的 CH3COONa-CH3COOH缓冲液进行修饰。

图5 不同缓冲体系中的修饰结果

2.3 RP-HPLC检测修饰保护剂的不同对修饰率的影响

经RP-HPLC分析(见图6)，2种修饰产物保留时间和修饰后的百分比基本一致，说明添加Lys和EDTA对目的产物的修饰率和修饰产物没有太大影响。但是考虑到修饰过程中可能出现非特异性修饰或修饰不均一等情况，决定加入2.0 mmol/L Lys和5.0 mmol/L EDTA作为修饰保护剂。

3 优化条件

通过上述实验，在采用分子量为40 kDa的mPEG-mal修饰ByC39多肽时，得到优化的修饰缓冲条件为:

①选择在pH值为6.5的条件下进行修饰。

②选择pH值为6.5的CH3COONa-CH3COOH缓冲液进行修饰。

③选择在终浓度为2.0 mmol/L的Lys和5.0 mmol/L的EDTA的保护剂环境中进行修饰。

通过这些条件的优化，可以提高修饰率以及增加修饰产物的稳定性。

图6 不同保护剂修饰后的结果

4 讨论

聚乙二醇(PEG)是一类拥有良好水溶性的大分子聚合物，修饰后的多肽和蛋白质类药物可增加药物的稳定性，延长药物的半衰期，降低免疫原性等。近年来在聚乙二醇定点修饰领域的研究也取得了较大的进步，考虑到修饰条件在修饰过程中对修饰率、修饰产物、蛋白的稳定性等方面都有较大的影响，因此修饰条件的优化研究对开拓新药研究也具有重要的意义。

艾塞那肽由礼来和Amylin两家公司共同研发并于2005年6月由美国FDA批准上市。它通过促胰岛素释放和抑制胰高血糖素释放、延缓胃排空、抑制食欲和改善β细胞功能等作用来调节血糖浓度，但是每日需要注射1次或2次，过短的半衰期限制了其在临床上的运用。聚乙二醇定点修饰后可延长其在体内的半衰期且活性不会降低，可以克服其在临床运用的缺陷，修饰后可达到长效的临床效果，具有很好的研究前景。本研究通过对修饰条件的优化，修饰率可达95%且修饰产物具有单一性，避免了在修饰过程中的一些非特异性的偶联以及自身形成二聚体的风险，达到定点修饰产物单一性的目的，并且可提高修饰产物的稳定性，延长半衰期，降低药物免疫原性和抗原性，进而解决胰岛素在体内的一些问题。但是对PEG化后的药物在体内药物代谢动力学性质还需进一步研究，以监控药物在体内的不良反应。本研究为新药的开发和临床应用研究提出新的方向。

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