A1位PEG化的重组人胰岛素类似物的制备和鉴定

刘立平，曹 宇，蔡晓娜，贺晓强，范 开，

(1重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054;2.重庆富进生物医药有限公司，重庆 400041)

胰岛素作为一种治疗1型糖尿病和2型糖尿病晚期的常用药物之一，具有半衰期短的特点。经过化学修饰，胰岛素可在保持生物活性的同时延长半衰期［1-2］。化学修饰剂的结构必须具有稳定性、无毒性、无抗原性，并具有合适大小的相对分子质量。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一种具有较好生物相容性的高分子化合物，对人体无毒性。它是以-CH2CH2O-为基础结构的大分子线性或分枝状多聚物。用PEG对蛋白进行共价修饰可降低蛋白免疫原性，增加蛋白质溶解度，并延长蛋白的半衰期［3］。目前FDA已批准多种PEG修饰的重组蛋白药物上市，如Hoffmann的用于治疗慢性丙型肝炎的PEG化的IFN a-2a(商品名为Somavert);Amgen的用于治疗粒细胞减少的PEG化G-CSF(商品名为Neulasta);Enzon公司研发的用于治疗白血病和黑色素瘤的PEG化于天冬酰胺(商品名为Oncaspar)。目前上市的特长效胰岛素是将天然人胰岛素B链第30位苏氨酸去掉的胰岛素类似物(命名为DET，结构见图1)。然后在B链第29位赖氨酸(Lys)上结合一个14 C游离脂肪酸，脂肪酸可与血液中的白蛋白结合，形成白蛋白结合体，延长其作用时间［4］。现有胰岛素修饰研究多关于 B29 位［1，5-8］，本文尝试修饰一种人胰岛素类似物［9］的A1位甘氨酸位点。

mPEG有4种活性基团:mPEG-SPA、mPEGNHS、mPEG-NPC、mPEG-SC，后 3 种均易水解，在水溶液中半衰期短，仅能维持5～10 min，修饰效率低。而mPEG-SPA半衰期长，可维持30 min，且mPEG-SPA已用于多种上市PEG药物修饰(如Oncaspa和Somavert)，偶联后蛋白性质稳定，安全性高，故本文优选mPEG-SPA作为最终的活性基团对DET进行修饰。mPEG-SPA修饰蛋白的原理是通过PEG与蛋白质游离氨基反应，PEG上的活性基团琥珀酰亚铵基团(SPA)被蛋白质游离氨基取代，聚乙二醇就与游离氨基以酰胺键共价结合(见图2)。该反应是亲核反应。亲核反应时，当反应溶液的pH值与被偶联的氨基pKa值相近时，该位点氨基最容易被修饰［10］;当反应溶液的pH值与其pKa值相差过大时，该位点氨基被质子化，难被修饰。DET分子中有3个可作为单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-succinimidyl propionate，mPEG-SPA)氨基修饰的位点:GlyA1(pKa≈8.0)α-氨基、PheB1(pKa ＜7.0)的 α-氨基、LysB29(pKa≈9.5)的 ε-氨基。

本文在pH=8.0时，选择对DET分子中的GlyA1特异性用 PEG修饰(命名为PEG-DETA1)，但修饰过程中可能会有mPEG-SPA非特异性地修饰在LysB29或PheB1上，形成的相关物质分别命名为PEG-DET-B29或PEG-DET-B1。修饰后通过阳离子Source 30Q层析得到PEG-DET-A1，并验证其结构［11］。

图1 去D30重组人胰岛素类似物(DET)的结构

图2 mPEG-SPA修饰原理

1 材料设备和方法

1.1.1 材料

乙腈、氯化钠、相对分子质量为20 kD的mPEG-SPA，购于北京键凯科技有限公司;DET来源于重庆富进生物医药有限公司;其他均为市售分析纯试剂。

1.1.2 设备

AKTA Basic纯化仪，购自GEhealth care公司;制备型预装Source 30Q层析柱，购自GEhealth care公司;Agillent 1200型高效液相色谱仪;Dionex DNA Pac PA-100阴离子柱(4×250 mm，戴安中国有限公司);Welch Materials Ultimate®XB-C18色谱柱。

1.2 方法

1.2.1 PEG-DET-A1制备

取DET冻干粉50 mg用50 mm Tris-双蒸水溶解，蛋白终浓度为10 mg/mL，总体积5 mL。精确称量400 mg的分子量为20 kD的mPEG-SPA溶解在5 mL的乙腈中。将两者等体积混合，精确调节pH=8.00，在室温下缓慢搅拌反应1 h后，用阳离子Source 30Q分离纯化，用SAX-HPLC高效液相色谱层析柱检测。阳离子Source 30Q分离纯化流动相A:2 L双蒸水中加入50 mm PB、30%甲醇、pH 8.80;流动相B:流动相A中加入300 mm氯化钠;检测波长为280 nm，流速为20 mL/min，柱温为室温。制备过程(新自然段):首先用3个柱体积的流动相A冲洗制备型预装Source 30Q层析柱，再将修饰后的样品泵入制备型预装Source 30Q层析柱，用3个柱体积的流动相A冲洗制备型预装Source30Q层析柱，然后运行0% ～20%流动相B，20个柱体积的线性梯度洗脱，依次收集第1个峰(PEG-DET-A1)、第2个峰(PEG-DET-B29)、第3个峰(未被修饰的DET)，见图3。把收集的第1个峰按1mL支分装西林瓶，冻干熔封，得到PEGDET-A1蛋白样品，-20℃保存备用。

1.2.2 PEG-DET-A1鉴定方法

1)SAX-HPLC分析。取一支PEG-DET-A1样品用1 mL双蒸水溶解后进样20 μL，记录色谱图(图4)。流动相A液 :Tris 6.057g加入约700 mL水溶解，用1M盐酸调节pH值至9.0，再加入200 mL乙腈，混匀后用水稀释至1 000 mL;B液:取A液500 mL，加入氯化钠8.766 g。流速:0.5 mL/min;检测波长:276 nm;柱温:室温;梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2)质谱分析。取一支PEG-DET-A1样品用1 mL双蒸水溶解后与5 mg/mL的HCCA基质1 mL等体积1∶1混合后，委托重庆前沿生物公司进行质谱分析，结果见图5。

3)质量肽图分析

质量肽图分析法是修饰位点确认的常用方法之一，通过酶切比较修饰前样品和修饰后样品的肽段，消失或部分减少的肽段确认为被修饰的肽段，进而确认修饰位点。取DET和PEG-DET-A1各一支，分别用pH值为7.8的100 mm Tris-HCl pH 7.8溶解，稀释浓度为1.0 mg/mL。各取样100 μL 并加入 1 μg V8 酶酶切(酶切比例 100∶1)，37℃水浴反应8 h后立即进样。采用Welch Materials Ultimate®XB-C18色谱柱;流速为1.0 mL/min;检测波长为214 nm;柱温为30℃;0.1%三氟乙酸-5%乙腈的水溶液为流动相A;0.1%三氟乙酸-95%乙腈溶液为流动相B;进行梯度洗脱。70 min内流动相B从0%增至70%，用Aglient 1100 HPLC/MS液质联用色谱仪对各肽段进行质谱分析，结果见图6。

2 结果与分析

2.1 PEG-DET-A1制备结果

图3中有多个峰，说明在形成所需PEG-DET-A1的同时还形成了闲逛物质，并残留了未修饰的DET。第1个峰为PEG-DET-A1，对应 SDS-PAGE中的 A1;第2个峰为PEG-DET-B29，对应 SDSPAGE中的 B29;第3峰为DET，第三孔 Marker。结合SDS-PAGE可看出:第1和2峰均为纯度较高的分子量接近45kD的修饰物，且PEG-DET-A1、PEG-DET-B29、DET所占比例相当，因此可以进一步改进工艺，以提高PEG-DET-A1的比例。

图3 Source 30Q柱层析图

2.2 SAX-HPLC分析结果

将经30Q柱层析收集所得的PEG-DET-A1进行SAX-HPLC分析，结果见图4。由图4可以看出:在保留时间10.121 min形成明显单蜂，用面积归一法测得纯度为93.4%，初步肯定收集的PEGDET-A1为单一物质;在保留时间12.23 min为已相关物质峰，所占比例较小，为6.6%。

图4 PEG-DET-A1的SAX-HPLC纯度分析

2.3 质谱分析结果

取PEG-DET-A1样品进行MALDI-TOF质谱相对分子量的测定，结果见图5。图5显示:PEGDET自制对照品质谱分子量测定值为25 245.07 Da，与理论值25 706.64 Da相差446 Da。聚乙二醇是以乙二醇为单位的多聚物，具有多分散性。根据聚乙二醇的特点，其较难质子化，因此在做聚乙二醇的质谱时(特别是大分子量的聚乙二醇)都存在一定的偏差。本文中PEG-DETA1测定值和理论值误差仅为1.7%，在合理偏差范围内，因此可认为本文中PEG-DET-A1是由一个分子的DET偶联一个PEG制备而成。

图5 PEG-DET-A1质谱分子量

2.4 质量肽图分析结果

MALDI-TOF/TOF质谱分子量测定确定了制备的PEG-DET-A1是一个分子的DET偶联一个PEG制备而成，但还不能确定PEG偶联在DET上氨基酸的具体位置。通过质量肽图分析可知:DET用V8酶酶切后，用Aglient 1100 HPLC/MS液质联用色谱仪测定共有5个肽段峰(图6(a))，通过与DET酶切理论肽段分子量比较分析(表2)，确证5个肽段的分子量测定值与理论值一致。PEG-DETA1(图6(b))与DET质量肽图中的2、3、4号肽段保留时间一致，PEG-DET-A1中1号肽段消失，在57.468 min处增加了一个新肽段，原因是PEG修饰了DET的1号肽段，进而增强了1号肽段的非极性，造成1号肽段保留时间延长，因此推断出1号肽段被PEG修饰。在1号肽段中，只有A1位甘氨酸残基可被PEG修饰，即PEG-DET-A1为1个PEG分子修饰在一个DET分子的A1位甘氨酸残基形成的。

图6 质量肽图

3 结束语

通过修饰和纯化工艺，可获得较高纯度的PEG-DET-A1样品，经进一步纯化即可获得纯度更高的药用级的蛋白。本工艺可为同类蛋白药物的放大生成提供参考。针对PEG化蛋白药物修饰位点的鉴定，质量肽图分析法是最灵敏、最高效的方法。通过质量肽图分析法鉴定本工艺制备的PEG-DET-A1蛋白，结果表明 PEG确实修饰在DET蛋白A链的第1位甘氨酸上，和设计的修饰位点一致。同时，理论上PEG-DET-A由于分子量比较大，与胰岛素受体结合力减弱，不能快速经肾脏排泄，经肝脏的代谢灭活速度减慢，进一步延长了在血液中的保留时间，可实现PEG-DET的长效降血糖的目的。因此，PEG-DET-A1可作为一种治疗1型和2型糖尿病的长效胰岛素候选药物。

［1］高剑坤.一种新型长效人胰岛素类似物的研制［D］.重庆:重庆大学，2007.

［2］Walsh G.Second-generation biopharmaceuticals［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2004，58:185-196.

［3］Pasut G，Francesco M.Veronese.State of the art in PEGylation:The great versatility achieved after forty years of research［J］.Journal of Controlled Release，2012，161:461-472.

［4］窦怀智，单修饰聚乙二醇化胰岛素的研究［D］.上海:复旦大学，2008.

［5］J·M·比尔斯，G·B·库特勒.聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物［P］.中国专利 CN10265884A，2012.09.12.

［6］印春华，窦怀智，张敏.一种单修饰的聚乙二醇化胰岛素及其制备方法［P］.中国专利CN200610118923.2，2007.05.30.

［7］Bartley P C，Bogoev M，Larsen J，et al.Long-term efficacy and safety of insulin detemir compared to neutral protamine Hagedorn insulin in patients with Type 1 diabetes using a treat-to-target basal-bolus regimen with insulin aspart at meals:a 2-year，randomized，controlled trial［J］.Diabet Med，2008(25):442-449.

［8］Jonassen I，Hoeg-Jensen T，Havelund S，et al.New insulin derivative comprising a naturally occurring insulin with a side chain attached to the alpha-amino or epsilonamino in the B chain of the parent insulin，useful in composition for treating diabetes［P］.PCT，.WO2005012347-A2.

［9］Vajo Z，Fawcett J，Duckworth W C.Recombinant DNA Technology in the Treatment of Diabetes:Insulin Analogs［J］.Endocr Rev，2001，22(5):706-717.

［10］Roberts M J，Bentley M D，Harris J M.Chemistry for peptide and protein PEGylation［J］.Adv Drug Deliv Rev，2002，54(4):459-476.

［11］吴志民.胰岛素的mPEG修饰及其活性表征［J］.化学学报，2011，69(23):2889-2895.