HS-SPME同时萃取衍生化定量白酒中反-2-烯醛和二烯醛类化合物

曹长江，范文来，聂 尧，徐 岩

(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物工程学院酿酒微生物与应用酶学研究室，江苏无锡214122)

醛类是饮料酒香气重要成分，由微生物发酵及脂肪［1］和醇类［2］氧化产生。反-2-烯醛和二烯醛类属于不饱和醛类，在饮料酒中的含量低［3-6］，但由于其较低的阈值［7］，对饮料酒的香气有很大贡献［4］。

碘量法和比色法是醛类检测的常规方法［2］，主要检测白酒中醛类总量。利用顶空固相微萃取(HS-SPME)检测白酒中醛类，受到醛类极性、沸点、萃取头类型，以及饮料酒基质干扰的影响，导致检测灵敏度不高，只能定量白酒中部分饱和醛［8-9］。采用衍生化方法，能提高检测灵敏度，去除基质干扰。常见衍生化试剂有 2，4-二硝基苯肼［10］、五氟苯肼［11］以及邻五氟苯甲基羟胺(PFBHA)［3，12-13］等，其中 PFBHA具有衍生效率高，衍生剂用量小等特点［12］，如López-Vázquez［3］等用 PFBHA 衍生化 SPME 法在葡萄皮渣蒸馏酒中定量检测5种反-2-烯醛和4种二烯醛类化合物;Saison［4］等利用 PFBHA衍生化 SPME法检测啤酒中6种反-2-烯醛和1种二烯醛类化合物;Sowiński［6］等利用 PFBHA 衍生化检测伏特加酒中 2种反-2-烯醛和 8种饱和醛。Ferreira［13］等利用PFBHA衍生结合固相萃取(SPE)应用GC-MS定量检测葡萄酒中反-2-壬烯醛和反，顺-2，6-二烯醛。

中国白酒中醛类检测主要集中在总醛和饱和醛类上。李侠［14］利用光度法测定白酒中醛类总量，王晓欣［8］利用HS-SPME结合GC-MS检测浓香型习酒香气物质时，检测到乙醛、2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、己醛、壬醛、癸醛等6种饱和醛类，张灿［15］利用浸入固相微萃取检测白酒中异嗅化合物时，检测到反-2-壬烯醛(检测限为1．55μg/L)。范文来［16］等利用液液萃取结合正相色谱，采用GC-MS的检测方法，在我国清香型和酱香型白酒中共定性出6种反-2-烯醛和6种二烯醛类化合物，没有对其进行准确定量。

本实验运用PFBHA作衍生化试剂，HS-SPME同时萃取衍生和GC-MS联用的方法共定量我国白酒中14种反-2-烯醛和二烯醛类化合物。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

反-2-戊烯醛(纯度 95%)、反-2-己烯醛(95%)、反-2-庚烯醛(95%)、反-2-辛烯醛(94%)、反-2-壬烯醛(97%)、反，反-2，4-己二烯醛(95%)、反，反-2，4-庚二烯醛(88%)、反，反-2，4-辛二烯醛(95%)、反，反-2，4-壬二烯醛(85%)、反，反-2，4-癸二烯醛(85%)、反，顺-2，6-壬二烯醛(95%)、对氟苯甲醛(内标，98%)、邻五氟苯甲基羟胺(PFBHA，98%)Sigma-Aldrich公司;乙醇 色谱纯，上海安谱科学仪器公司;氯化钠 分析纯，国药集团化学试剂有限公司;水 超纯水，Milli-Q系统纯化。

气相色谱质谱联用仪，Agilent GC 6890-MSD 5975 美国Agilent公司;自动进样装置(MPS2) 德国Gestel公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;DVB/CAR/PDMS三相萃取头 加拿大Supelco公司。

1.2 实验方法

1．2．1 内标、反-2-烯醛和二烯醛类标准液及衍生剂溶液的配制 参照文献［4］，准确称量14．30mg的对氟苯甲醛(内标)，用色谱纯乙醇定容至100mL，再用色谱纯乙醇稀释500倍(浓度为1．0724mg/L)，-20℃储存，作为内标溶液以备使用。分别准确称取1．86～5．77mg的14种反-2-烯醛和二烯醛类标准品，溶解于100mL色谱纯乙醇，-20℃储存，作为单标溶液以备使用。

1．2．2 样品预处理 用煮沸后冷却至室温的超纯水将酒样稀释至酒精度10%vol，准确吸取8mL置于20mL顶空瓶中，加入8μL内标对氟苯甲醛溶液(最终浓度为 1．0724μg/L)和 300μL 的衍生化试剂PFBHA溶液，旋紧瓶盖，待分析。

1．2．3 HS-SPME同时萃取衍生化条件优化 参考López-Vázquez［3］的方法，同时萃取衍生化。用自动进样装置(MPS2)进行样品HS-SPME同时萃取衍生化，衍生反应时间为10min，酒样稀释至10%vol，同时萃取衍生化温度为65℃，萃取衍生化时间为45min，加 3g NaCl。

对主要参数进行优化。考察酒精度(10%vol、20%vol和30%vol)、同时萃取衍生化温度(45、50、55、60、65、70 和 80℃)、同时萃取衍生化时间(15、30、45和60min)和离子强度对反-2-烯醛和二烯醛类检测的影响。

1．2．4 GC-MS 条件 GC 条件:载气 He(纯度99．9995%)，流速 2mL/min，不分流进样;色谱柱:DB-Wax(60m × 0．25mm × 0．25μm)。进样口温度250℃，解吸附300s。升温程序为:50℃保持2min，以6℃ /min升至 100℃，保持 0．1min，以 2℃ /min 升至160℃，保 持 0．1min，以 5℃/min 升 至 230℃，保持15min。

MS条件:电子电离(EI)，电子能量70eV，离子源温度 230℃，SCAN 模式扫描范围为 35．00～380．00amu。质谱分析使用NIST05a．L数据库。

1．2．5 定性和定量 通过对比衍生化后酒样和反-2-烯醛和二烯醛类标准品衍生后的保留时间以及NIST05a．L数据库提供的质谱图对照，利用匹配度、特征离子以及保留时间进行定性分析。

用选择特征定量离子(SIM)的方法对反-2-烯醛和二烯醛类衍生物进行积分，衍生产物有顺，反异构体的，以两个离子峰面积之和计算(见图1)。以14种反-2-烯醛和二烯醛类衍生物特征离子峰与内标的特征离子峰(m/z 319)的峰面积之比为横坐标(x)，反-2-烯醛和二烯醛类与内标浓度之比为纵坐标(y)绘制标准曲线。

向白酒样品中添加与酒中浓度相近的、相应的反-2-烯醛和二烯醛类标准溶液，进行回收率和精密度测定。

2 结果与讨论

醛类化合物与PFBHA反应得到的衍生产物，除个别形成单峰，一般是两个色谱峰(即顺，反异构体)［17-18］。本实验研究的醛类除反-2-壬烯醛和反，顺-2，6-壬二烯醛的衍生产物为单峰，其他均为两个峰，如图1所示。计算峰面积时，除反-2-壬烯醛和反，顺-2，6-壬二烯醛为一个离子峰外，其他物质均以两个离子峰面积总和来计算。

2.1 同时萃取衍生条件优化

本研究共涉及14种反-2-烯醛和二烯醛，包括8种反-2-烯醛类和6种二烯醛类。根据化合物结构相似，性质相似的原理，选取反-2-壬烯醛和反，反-2，4-壬二烯醛分别代表反-2-烯醛类和二烯醛类化合物，进行萃取条件优化。考察了影响不饱和醛类同时萃取衍生效率的因素主要包括酒精度、萃取温度、萃取时间、离子浓度等。

2．1．1 酒精度的优化 酒精度优化时分别选取10%vol，20%vol和30%vol三个酒精度，结果以相对峰面积比值表示(相对峰面积比值:同一物质在不同酒精度下的峰面积中，选取最大峰面积并设定为100，其他酒精度条件的峰面积除以最大值的实际值，得到的比值)。由图2可以看出:20%vol和30%vol的酒精度下，两个化合物的萃取效果都显著降低。10%vol的酒精度的萃取效果最好。这一结果与早期研究白酒微量成分检测与香气［19］时采用的酒精度一致，所以选取10%vol的酒精度为样品测定酒精度。

图1 豉香型白酒样品与PFBHA反应的反-2-烯醛和二烯醛类衍生物离子图谱Fig．1 Extracted ions chromatograms of trans-2-alkenals and alkadienals oxime derivatives of soybean aroma type liquor

2．1．2 萃取温度的选择 由图3可以看出，萃取效率随萃取温度升高先上升后下降，这一趋势与文献报道一致［4］。当萃取温度升到65℃时，反-2-壬烯醛和反，反-2，4-壬二烯醛的萃取效果最好，温度继续升高，萃取效率降低。温度从40℃升高到65℃过程中，不饱和醛反-2-烯醛和二烯醛类化合物随着温度的升高从酒样中挥发到空气中，从而增加萃取头的吸附效率;但当温度继续升高时，加速了萃取头上不饱和醛类的解吸附，降低了萃取效率。Sowiński［6］验证了在30、50和70℃条件下，PFBHA衍生产物的萃取效率，结果为70℃的萃取效率最高，与本研究结果接近。故选择65℃作为实验萃取温度。

图2 不同酒精度下的萃取效果Fig．2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

图3 不同萃取温度下的萃取效果Fig．3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2．1．3 萃取时间的选择 López-Vázquez［3］等人选取2、5、10min和15min考察了衍生反应时间，结果显示衍生反应时间对萃取结果没有影响，这可能是醛类和PFBHA反应迅速，所需时间小于2min。本实验选择预热5min作为反应时间进行萃取时间优化。

由图4可见，当萃取时间从15min增加到45min时，不饱和醛类的萃取效率显著增加，萃取时间超过45min后，不饱和醛类的萃取效率增加幅度不大，趋于平衡，此时达到吸附和解吸附平衡。Saison［4］报道萃取时间40min，二者结果相似。故选取45min为样品萃取时间。

2．1．4 离子强度 由图5可见，样品中离子强度较大时(即加入3g NaCl饱和，使样品溶液饱和)，萃取效率高于离子强度较低时(即不添加NaCl)。为了得到最佳萃取效果，选择样品中加入3g NaCl，再进行萃取。

文献中报道溶液离子强度对萃取效率的影响并不一致。这一结果与 Saison［5］和 Sowiński［6］的结论一致，Saison认为液相中离子强度增加，提高了液相中化合物扩散到气相的比例，从而提高顶空萃取效率［5］，NaCl的添加有助于提高萃取效率。而 López-Vázquez［3］实验结果与此相反，即 NaCl的添加降低萃取效率，认为高的离子浓度影响醛类衍生物的形成，从而影响醛类衍生物萃取效率。

表1 反-2-烯醛和二烯醛类的定量相关参数Table 1 Quantification parameters of trans-2-alkenals and alkadienals

图4 不同萃取时间的萃取效果Fig．4 Effect of extraction time on extraction efficiency

图5 不同离子浓度下的萃取效果Fig．5 Effect of ionic concentration on extraction efficiency

因此，HS-SPME同时萃取衍生化的条件是酒样稀释到酒精度10%vol，样品中加入3g NaCl，同时萃取衍生化温度65℃，萃取衍生化时间45min。

2.2 线性范围与检测限

由表1可知，该方法对于14种反-2-烯醛和二烯醛类有很宽的线性范围，线性关系很好，相关系数(R2)均在0．9924(反-2-辛烯醛)以上。选取信噪比为3时的质量浓度作为检测限(limit of detection，LOD)，检测限从 0．014μg/L(反 -2- 庚烯醛)到0．186μg/L(反-2-十一烯醛)，较 HS-SPME 非衍生化检测方法(反-2-壬烯醛，检测限 1．55μg/L)［15］更低，能满足白酒中低浓度不饱和醛类的检测要求。

2.3 精密度和回收率实验

由表2可知，14种反-2-烯醛和二烯醛类化合物的回收率在84．47%～116%之间，RSD值均小于10．99%。说明该方法有良好的准确度和精密度，能够满足分析要求。

2.4 白酒中反-2-烯醛类和二烯醛类化合物的检测结果

选取了浓香型、清香型、酱香型等8种香型白酒的原酒定量检测，检测结果见表3。

在检测的8种香型的白酒中，豉香型白酒不饱和醛类总量最高，达1077．36μg/L(表3)，酱香型和兼香型白酒的不饱和醛类总量最低，小于32．95μg/L，其他各香型白酒中不饱和醛类总量在107．30～141．50μg/L范围。其中含量最高的是豉香型白酒中反-2-辛烯醛，达301．86μg/L。一般情况下，白酒中的反-2-烯醛类总量高于二烯醛类化合物，不同香型白酒中反-2-烯醛类和二烯醛类含量各不相同，这一现象可能与白酒酿造的原料和工艺有关，需要进一步的研究。

3 结论

应用邻五氟苯甲基羟胺(PFBHA)作衍生化试剂，采用HS-SPME同时萃取衍生化结合GC-MS技术，建立了白酒中反-2-烯醛和二烯醛类的定性、定量方法。该方法准确度、精密度高，检测限低，并且定量检测反-2-烯醛和二烯醛类的种类达到14种，能满足白酒中反-2-烯醛类和二烯醛类化合物的检测要求，有助于分析比较不同白酒产品之间的重要风味物质差别，为白酒品质的改进提供必要的手段和相关理论依据。

表2 白酒中反-2-烯醛和二烯醛类化合物的加标回收率和精密度(n=3)Table 2 Accuracy and standard recovery tests of trans-2-alkenals and alkadienals in Chinese liquor(n=3)

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