HPLC法测定烤羊肉串中胆固醇研究

孙金旭

（衡水学院，河北衡水053000）

胆固醇是人体内胆汁酸，固醇激素等的前体，它是引起胆结石和动脉粥样硬化的重要原因之一[1]，因胆固醇对人类，特别是中老年人的身体健康影响较大，所以人们对饮食中的胆固醇含量的重视程度很高，如何控制胆固醇的摄入量，各种食品中胆固醇的检测更加重要，建立快速、简洁的胆固醇测定方法已迫在眉睫，目前，胆固醇的主要检测方法有气象色谱法（GC）、比色法及其它方法，采用HPLC（高效液相色谱法）测定食品中的胆固醇含量为我国现行国标[2-4]，本研究是在对烤羊肉串前期处理的基础上，采用HPLC法测定其中的胆固醇含量，旨在建立烤羊肉串中胆固醇快速、简洁的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烤羊肉串：市售；胆固醇标准品（购于国家标准物质网）。

甲醇、异丙醇、乙腈（色谱级）购于潍坊中汇化工有限公司；无水乙醇、石油醚、乙醚均为分析纯（杭州辉煌化工有限公司）。

1.2 仪器与设备

Agilent1100高效液相色谱：美国；EV311旋蒸仪：莱伯泰科有限公司；电子天平：上海田宫称重制造有限公司。

1.3 样品处理方法

1.3.1 样品皂化[5]

精密称量已经切碎的烤羊肉串5 g于500 mL平底烧瓶中，添加60 mL无水乙醇和20 mL浓度为6 g/mL的KOH溶液，将处理好的样品置于恒温磁力搅拌器上皂化回流 1.5 h（300 r/min、150 ℃），结束后用 10 mL的无水乙醇冲洗冷凝管，洗液放入平底烧瓶中，冷却至室温。

1.3.2 样品提取

转移经皂化后的溶液于500 mL的分液漏斗中，用50 mL水冲洗平底烧瓶并将洗液一并转入分液漏斗中，再用80 mL的乙醚和石油醚（1∶1）混合液分次冲洗平底烧瓶，并将洗液一并转入分液漏斗中，振摇分液漏斗5 min，静置，待分层后，将分液漏斗中的水相转入另一分液漏斗中，加入80 mL的乙醚和石油醚（1∶1）混合液重复提取水相2次～3次，合并有机相，用蒸馏水清洗有机相至中性，将有机相转移至300 mL的平底烧瓶中待处理。

1.3.3 提取液浓缩处理

将上述处理后的平底烧瓶中的提取液在45℃条件下，真空旋转蒸发至干残渣，用无水乙醇溶解残渣并转移到10 mL的容量瓶中，无水乙醇定容至刻度摇匀后微孔过滤膜过滤处理后既得。

1.3.4 标准品的制备

精确称取一定量的标准品，置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀后待用。

1.3.5 液相色谱测定条件[6]

色谱柱：C18柱（Agilent公司）；柱温 35℃；流动相：乙腈；流速 1.0 mL/min；进样量 10 μL，检测器：紫外检测器；检测波长：205 nm；柱压：48 Pa。

1.3.6 相对标准偏差计算

相对标准偏差计算公式如所示。

1.3.7 回收率计算

回收率计算公式如下：

式中：A为回收率；W为原覆烤羊肉串中胆固醇含量，mg；Z为加标量，mg；E为加标后测定混合液中胆固醇含量，mg。

2 结果与讨论

2.1 胆固醇标准品HPLC液相色谱图

胆固醇标准品HPLC色谱测定条件如下：色谱柱：C18柱（Agilent公司）；柱温 28℃；流动相：乙腈；流速1.0 mL/min；进样量 10 μL，检测器：紫外检测器；检测波长：205 nm，测定结果如图1所示。

图1 胆固醇标准品HPLC色谱图Fig.1 The HPLC spectra for cholesterol standard

由图1可知，胆固醇标准品在设定的测定条件下，在17.386 min处有胆固醇标准峰，表明该测定条件适宜于胆固醇的测定。

2.2 绘制胆固醇含量标准曲线

分别取已配置好的胆固醇标准品溶液0、0.5、2、4、6、8、10 mL，分别置于 20 mL 的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，取10 μL，按上述HPLC测定条件进样测定，以峰面积为横坐标，胆固醇标准品浓度（mg/L）为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

图2 标准品标准曲线Fig.2 The standard curve

如图2所示，胆固醇标准品峰面积与浓度对应的标准曲线方程为Y=78.26x-0. 0025，线性范围在0 mg/mL～10.0 mg/mL之间，相关系数R为0. 9981。

2.3 精密度实验

取同一供试样品，经微孔过滤器过滤后，重复进样5此，计算每次胆固醇的出峰时间和峰面积，结果如表1所示。

由表1可知，根据5次测定时的出峰时间及出峰面积计算得出峰面积RSD为0.52%，保留时间RSD为0.03%，说明此试验设计条件精密度良好。

2.4 重现性实验

取同一羊肉串样品6份，按所确定的样品制备方法和色谱条件进行胆固醇含量分析，结果见表2。

表1 峰面积及出峰时间表Table 1 Peak area and time

表2 重现性实验结果Table 2 Reproducibility of the method

如表2所示，经检测后的羊肉串样品胆固醇含量平均值为123.48 mg/100 g，经计算后胆固醇含量的RSD值为0.38%，表明该方法测定胆固醇含量重现性较好，实验结果可靠。

2.5 回收率实验

取经处理好的羊肉串样品处理液300 mL，平均分为3份，分别测定其中的胆固醇含量，分别取浓度为20 mg/100 mL的胆固醇标准品10、20、30 mL，分别添加到样品中，经过滤膜过滤后分别测定胆固醇含量，计算回收率，结果如表3所示。

表3 样品回收率表Table 3 The sample recovery

由表3可知，经加标后，胆固醇标品的回收率在98.60%～100.92%之间，表明标品回收良好，此方法适宜于烤羊肉串中胆固醇含量的测定。

2.6 样品HPLC色谱图及含量测定

经处理后的样品按标准品测定色谱条件进行测定，结果如表3所示。

图3 样品胆固醇测定HPLC色谱图Fig.3 The HPLC spectra for cholesterol in shish kebab

如图3所示，在设定的HPLC色谱条件下，样品测定的色谱谱图中，共有10个峰，前9个峰分离效果不是太好，但第10个峰和其它9个峰分离较好，和胆固醇标准品的色谱图相对照，在17.413 min处出的单独峰为胆固醇峰，表明此色谱条件较适宜于样品测定条件。

取5批样品经处理后，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，进样后，按上述色谱条件测定峰面积值，计算胆固醇含量，结果见表4。

表4 烤羊肉串中胆固醇含量测定表Table 4 The cholesterol content determination in shish kebab

如表4所示，经5批样品测定后，烤羊肉串中胆固醇含量的平均值为122.75 mg/100 g。

3 结论

利用HPLC法测定烤羊肉串中的胆固醇含量，色谱柱：C18柱（Agilent公司）；柱温 35℃；流动相：乙腈；流速1.0 mL/min；进样量10 μL，检测器：紫外检测器；检测波长：205 nm；柱压：48 Pa，进样量：10 μL，研究表明：此方法测定胆固醇含量最大标准偏差为0.38%，峰面积与胆固醇标品线性关系良好，标准曲线方程为Y=78.26x-0. 0025，相关系数R为0. 9981。精密度实验峰面积RSD为0.52%，保留时间RSD为0.03%，加标回收率在98.60%～100.92%之间，此方法用于测定烤羊肉串中的胆固醇含量准确、可行；经测定烤羊肉串中的胆固醇含量平均值为122.75 mg/100 g。

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