液态奶中防腐剂高效液相色谱前处理方法比较

钱聪

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

在食品中添加苯甲酸、山梨酸、糖精钠是为了防止食品腐败变质，延长保质期和降低生产成本，然而过多食用会危害人体健康，对于人们在饮食中不可缺少的液态奶而言，防腐剂的检测保证其安全极其必要。液态奶中防腐剂检测的前处理方法和沉淀剂的选择尤为重要[1-3]，GB 21703-2010《乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定》的食品安全国家标准中样品前处理选择铁氰化钾和乙酸锌作为沉淀剂，同时在实验中需要用到酸和碱调节pH沉淀蛋白，过程较为繁琐，耗时较长。针对液态奶中防腐剂检测的前处理方法找到最佳的沉淀剂，更简便，更快速，实验结果稳定准确，是本实验的关键所在。

1 材料与方法

1.1 试剂

甲醇（色谱纯)：美国fisher公司；乙酸铵、乙酸锌、亚铁氰化钾均为分析纯：汕头市西陇化工厂；乙酸、硫酸、氢氧化钠，分析纯：北京化工厂。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠：国家标准物质中心。

1.2 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（Agilent公司，美国），配Agilent G1315 B二极管阵列检测器。

1.3 样品前处理

1.3.1 方法一

GB21703-2010乙酸锌和亚铁氰化钾沉淀法：准确称取5 g样品于25 mL比色管中，然后加入4 g/L氢氧化钠6 mL，超声水浴处理15 min，再用30 ml/L硫酸调pH到8，再加106 g/L亚铁氰化钾和219 g/L乙酸锌各2 mL，剧烈振摇后用甲醇定容。

1.3.2 方法二

0.2%乙酸沉淀法：准确称取5 g样品于25 mL比色管中，加入15 mL 0.2%乙酸水溶液，涡旋2 min，用0.2%乙酸水溶液人定容至刻度。

1.3.3 方法三

甲醇沉淀蛋白：准确称取5 g样品于25 mL比色管后，用甲醇定容摇匀。

经上述处理后，提取液经0.45 μm滤膜过滤，高效液相色谱分析。

1.4 标准溶液的配制

浓度分别为：0.005、0.010、0.025、0.050、0.100mg/mL，标准进样体积为10 μL。

1.5 色谱条件

色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C18柱：5μm，4.6mm×250 mm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：230 nm；流动相：甲醇—5 mmol/L乙酸铵溶液（3∶97）。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

比较了两种流动相的条件，分别为甲醇+乙酸铵（5∶95）、甲醇+乙酸铵（3∶97），由于在糖精钠出峰前有杂质峰干扰，最后选用甲醇+乙酸铵（3∶97）作为最佳条件，在此条件下3种防腐剂和样品中干扰物能达到较好的基线分离，而且出峰时间适中，色谱条件的测定结果令人满意，见图1。

图1 苯甲酸、山梨酸、糖精钠分别在两种流动相的条件下分离情况Fig.1 Benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in two kinds of mobile phase conditions separation

2.2 样品前处理方法研究

如何使乳品中的蛋白质完全沉淀并得到满意的实验结果这是此次实验的关键所在，在本次试验中做了如下的试验比较：第一：在几个沉淀剂的选择上做出了比较，首先考虑了乙腈和乙醇作为沉淀剂，但从峰形和加标回收率上来看均不理想；第二：在实验操作过程中的复杂程度上做出了比较，在国标方法中需要用到酸和碱，还要调pH，相对于直接用0.2%乙酸或者甲醇沉淀蛋白的方法，操作过于繁琐；第三：从沉淀效果上做出比较，用0.2%乙酸作为沉淀剂的沉淀效果好，容易过滤。3种前处理方式虽然在操作过程中和沉淀效果上都有所差异，但在色谱图上显示均能实现与基质成分的基线的分离，定量并未受到干扰，见图2。

图2 苯甲酸、山梨酸、糖精钠分别在甲醇（a）、0.2%乙酸（b）、国标（c）前处理方法的谱图Fig.2 The benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in methanol（a），0.2%acetic acid（b），national standard（c）spectra pretreatment methods

2.3 线性和检出限

在选定的色谱条件下，在0.005mg/mL～0.100mg/mL范围内3种食品添加剂标准溶液的峰面积与浓度之间呈现良好的线性关系，见表1。

2.4 加标回收率和精密度

取不含苯甲酸、山梨酸、糖精钠的鲜乳样品，加入高中低3个浓度梯度的防腐剂混标，加标浓度分别为50、12.5、2.5 mg/L，按照上述3种方法进行前处理，分别测定5次，计算其回收率和精密度，结果见表2。

表1 线性回归方程和检出限Table 1 Regression，correlation coefficient and detection limit

空白鲜乳样品中加标50 mg/L苯甲酸、山梨酸、糖精钠的色谱图分别见图3、图4、图5，图中均可看出苯甲酸、山梨酸、糖精钠与基质成分得到基线分离。

表2 3种方法加标回收率和精密度的实验（n=5）Table 2 Recovery（%）and relative standard deviation（RSD）（%）

图3 苯甲酸、山梨酸、糖精钠在方法1中色谱图Fig.3 The benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in method 1 Chromatogram

图4 苯甲酸、山梨酸、糖精钠在方法2中色谱图Fig.4 The benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in method 2 Chromatogram

图5 苯甲酸、山梨酸、糖精钠在方法3中色谱Fig.5 The benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in method 3 Chromatogram

3 结论

在本次实验中通过对3种前处理方法的比较可以看出，国标方法前处理采用酸、碱调节pH，乙酸锌和亚铁氰化钾沉淀蛋白，操作繁琐，而0.2%乙酸水溶液和甲醇沉淀蛋白的方法操作简单，相比而言前者的沉淀效果更好，提取液易于过滤。从加标回收率和精密度来看，3种方法均能满足液态奶中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的实际检测需求。在液相测定中，需要减小有机相的比例，使基质成分不会干扰糖精钠的测定。

[1] 王克新,房玉国,张立宏,等.HPLC法测定乳制品中的苯甲酸和山梨酸含量[J].中国乳品工业,2006(4)：54-55

[2] 卢丽明，周日东，黄诚，等.含乳饮料中苯甲酸、山梨酸、糖精钠测定的样品前处理方法探讨[J].华南预防医学,2005(6)：43-44

[3] 刘赐敏,周金森,刘钰钗,等.HPLC测定乳制品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的前处理方法研究[J].中国卫生检验杂志,2006(11)：1315-1316