气相色谱法测定菜粕异硫氰酸酯不确定度评定

张凤枰 杜雪莉 赵 艳 李应东 刘耀敏

(通威股份有限公司1，成都 610041)(上海海洋大学食品学院2，上海 201306)

气相色谱法测定菜粕异硫氰酸酯不确定度评定

张凤枰1,2杜雪莉1赵 艳1李应东1刘耀敏1

(通威股份有限公司1，成都 610041)
(上海海洋大学食品学院2，上海 201306)

对采用气相色谱内标法测定菜粕中的异硫氰酸酯含量的测量不确定度进行了评定。建立测量模型，分析确定菜粕中异硫氰酸酯含量的不确定度来源，并对测量过程中的不确定度分量进行逐层分析与合成，当菜粕的丙烯基异硫氰酸酯含量为99.2 mg/kg时，得到其合成标准不确定度和扩展不确定度分别为2.2、4.4 mg/kg。结果表明，校正因子测定引入的不确定度分量对合成标准不确定度的贡献最大，样品重复测定、回收试验和添加内标溶液带来的不确定度分量也不容忽视，试样称量对总不确定度的贡献最小，为采用该方法测定菜籽饼粕中异硫氰酸酯含量的质量控制提供了理论依据。

测量不确定度评定 气相色谱 内标法 丙烯基异硫氰酸酯 菜粕

测量不确定度是指根据所获信息表征赋予被测量值分散性的非负参数[1]，通过对测量不确定度的评定，不仅能够给出测量结果的可信程度，而且还可以对测量结果的质量进行定量评定，使测量结果可以在国际和国内不同检测机构间进行量值比对和实验室间数据共享。菜籽饼粕营养丰富，为潜力很大的优质蛋白饲料资源，已广泛应用于饲料加工业，但菜籽饼粕中含有硫苷(Glucosinolate)，在芥子酶作用下会转化成异硫氰酸酯(Isothiocyanate，ITC)、噁唑烷硫酮(Oxazolidine，OZT)、硫氰酸酯(Thiocyanate，TC)和腈类(Nitriles)等毒素，对动物机体有很大毒害作用。国家饲料卫生标准规定菜籽饼粕的异硫氰酸酯允许量为<4 000 mg/kg[2]，气相色谱法测定饲料中异硫氰酸酯的含量是国家标准检测方法[3]。有关异硫氰酸酯的化学性质、生物活性、测定方法等报道较多[4-7]，但采用气相色谱法测定菜粕中异硫氰酸酯含量的测量不确定度评定，国内外鲜见公开报道。本试验以气相色谱内标法测定饲料中丙烯基异硫氰酸酯的含量为例，按照最新的国际标准ISO/IEC Guide98-3—2008《测量不确定度表示指南》[1]、《CNAS-GL05:2011 测量不确定度要求的实施指南》[8]及《CNAS-GL06:2006 化学分析中不确定度的评估指南》[9]，建立测定过程中各分量的测量模型，对测定过程中各分量不确定度来源进行分析，在对各分量进行量化的基础上，合成得到了测定结果的标准不确定度和扩展不确定度，旨在为饲料生产企业菜粕的质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂和材料

7890A气相色谱仪，配7683B自动进样器、FID检测器：美国Agilent科技有限公司；CP224S、CP225D电子分析天平：德国Sartorius公司；ZHWY-2112F恒温培养振荡器：上海智诚分析仪器制造有限公司；Allegra 64R冷冻离心机：美国Beckman Coulter公司。

丙烯基异硫氰酸酯、正丁基异硫氰酸酯标准品(99.0±1.0)%：美国Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、柠檬酸、磷酸氢二钠、无水硫酸钠、丙酮(均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；试验用水为Milli-Q Gradient超纯水。

菜粕样品：通威股份有限公司技术中心提供。

1.2 异硫氰酸酯标准溶液的制备

按GB/T 13087—1991《饲料中异硫氰酸酯的测定方法》进行[3]。

正丁基异硫氰酸酯内标溶液：准确称取50 mg正丁基异硫氰酸酯标准品，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL，得1.000 mg/mL内标储备溶液；准确移取10 mL内标储备溶液于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷稀释定容，得0.100 0 mg/mL内标使用溶液。

丙烯基异硫氰酸酯标准溶液：准确称取1 000 mg丙烯基异硫氰酸酯标准品，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL，得20.00 mg/mL丙烯基异硫氰酸酯标准储备溶液；准确分别移取标准储备液5.0 mL于10、25、50、100 mL容量瓶内，用二氯甲烷稀释定容，得10.00、4.00、2.00、1.00 mg/mL丙烯基异硫氰酸酯标准使用液；分别准确移取4.00 mg/mL丙烯基异硫氰酸酯标准使用液5.0 mL于50、100 mL，用二氯甲烷稀释定容，得0.40、0.20 mg/mL丙烯基异硫氰酸酯标准使用液。

1.3 样品前处理方法

称取约2.2 g试样(精确至0.000 1 g)于具塞锥形瓶中，加入50 mL pH 7缓冲液，30 mg酶制剂，0.1 mg/mL丁基异硫氰酸酯内标溶液10 mL，25 ℃、120 r/min震荡2 h，将具塞三角瓶中内容物转入离心试管中，5 000 r/min离心5 min，用滴管吸取少量离心管下层有机相溶液，通过铺有少量无水硫酸钠层和脱脂棉的漏斗过滤，得澄清滤液备用，待气相色谱分析。

1.4 气相色谱条件

色谱柱：HP-FAAP弹性石英毛细管柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；色谱柱起始温度60℃，以5 ℃/min升到120 ℃，保持2 min；进样口温度：160 ℃；检测器温度：170 ℃；载气：高纯氮，柱流速：2.0 mL/min；氢气流速：35 mL/min；空气流速：400 mL/min；尾吹流速：20 mL/min；分流比：50∶1；进样量1 μL。

1.5 测定

按上述色谱条件，待基线稳定后，标样、试样溶液分别等体积进样，进行气相色谱分析，以样品峰的保留时间与异硫氰酸酯标准品的保留时间定性，内标法计算异硫氰酸酯的含量。

2 测量模型

式中：X为试样中丙烯基异硫氰酸酯的含量/mg/kg；F为校正因子；me为10 mL正丁基异硫氰酸酯内标的质量/mg；Sa为丙烯基异硫氰酸酯的峰面积；Se为正丁基异硫氰酸酯的峰面积；m为为试样质量/g。

3 不确定度来源分析

按照测量模型和测量方法，分析其不确定度来源有：校正因子测定产生的不确定度、样品称量产生的不确定度、添加正丁基异硫氰酸酯内标溶液产生的不确定度、样品重复测定产生的不确定度以及回收率产生的不确定度。

3.1 校正因子测定产生的相对标准不确定度urel(f)

分别准确移取0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0 mg/mL丙烯基异硫氰酸酯标准使用液1.0 mL于试管中，再分别加入1.000 mg/mL正丁基异硫氰酸酯内标储备溶液1.0 mL，涡旋混合2 min，得到系列混合标准溶液，经气相色谱分析，根据丙烯基异硫氰酸酯和正丁基异硫氰酸酯的质量、峰面积计算校正因子。

3.1.1 配制正丁基异硫氰酸酯内标储备溶液产生的相对标准不确定度urel(IS1)(测量不确定度B类评定)

3.1.1.1 正丁基异硫氰酸酯标准品引入的相对标准不确定度urel(ISp)

由标准物质证书可知：正丁基异硫氰酸酯的纯度为99.0%，最大允差为1.0%，因此可按均匀分布[1]计算出其相对标准不确定度为：

3.1.1.2 标准品称量产生的相对标准不确定度urel(ISm)

3.1.1.3 正丁基异硫氰酸酯内标溶液配制过程中器量校准引起的相对标准不确定度urel(ISV1)

使用容量瓶、单标线吸量管所导致的体积相对标准不确定度主要有3个分量：1)体积校准不确定度引起的相对标准不确定度分量urel1(V)，可按JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[10]规定的容量允差按三角分布计算；2)充满液体至刻度的变动性引起的相对标准不确定度分量urel2(V)，可通过A类不确定度评定得到，具体做法为连续核查10次排出的体积的相对标准偏差(通过称量决定)；3)溶液温度与检定标准温度(20 ℃)不同引起的相对标准不确定度分量urel3(V)，20 ℃水的体积膨胀系数为0.000 21/℃，按均匀分布求得。

表1 容量瓶、单标线吸量管的相对标准不确定度

设标准溶液温度与检定标准温度的温差为5 ℃，使用容量瓶、单标线吸量管引起的体积相对标准不确定度urel(V)计算结果见表1。

本次标液配制仅使用了50 mL容量瓶，由使用容量瓶引起的体积相对标准不确定度为：

因此，配制正丁基异硫氰酸酯内标储备溶液产生的相对不确定度为：

=0.59%

3.1.2 配制丙烯基异硫氰酸酯标准溶液产生的相对不确定度urel(S)(测量不确定度B类评定)

3.1.2.1 丙烯基异硫氰酸酯标准品引入的相对标准不确定度urel(Sp)

由标准物质证书可知：丙烯基异硫氰酸酯的纯度为99.0%，最大允差为1.0%，因此可按均匀分布[1]计算出其相对标准不确定度为：

3.1.2.2 丙烯基异硫氰酸酯标准品称量产生的相对标准不确定度urel(Sm)

3.1.2.3 丙烯基异硫氰酸酯溶液配制过程中容量瓶和吸量管引入的相对标准不确定度urel(SV)

本次标液配制使用了100、50、25、10 mL容量瓶和5 mL单标线吸量管，由使用容量瓶、单标线吸量管引起的体积相对标准不确定度为：

urel(SV)=

=0.48%

因此，配制丙烯基异硫氰酸酯标准溶液产生的相对不确定度为：

=0.75%

3.1.3 配制系列混合标准溶液过程中吸量管引入的测量不确定度urel(V1)(测量不确定度B类评定)

本次标液配制仅使用了1 mL单标线吸量管，由使用单标线吸量管引起的体积相对标准不确定度为：

由于品种、产地不同，菜粕的丙烯基异硫氰酸酯含量差异较大，为保证校正因子的准确性，试验设置了6个浓度梯度，每个浓度梯度进样2针，得到丙烯基异硫氰酸酯、丁烯基异硫氰酸酯色谱峰面积，根据添加的质量、峰面积计算校正因子，结果见表2。

表2 校正因子测定结果

标准不确定度采用平均值的标准偏差：

=0.004 1

校正因子测定过程中产生的相对标准不确定度为：

因此，校正因子测定产生的相对标准不确定度为：

=1.74%

3.2 样品称量产生的相对标准不确定度urel(m)(测量不确定度B类评定)

3.3 添加正丁基异硫氰酸酯内标溶液产生的相对不确定度urel(me)(测量不确定度B类评定)

这部分的不确定度由以下2个分量合成：配制正丁基异硫氰酸酯内标溶液产生的不确定度urel(IS2)、加入内标溶液体积引入的相对标准不确定度urel(V2)。

3.3.1 配制正丁基异硫氰酸酯内标溶液产生的相对不确定度urel(IS2)

3.3.1.1 正丁基异硫氰酸酯标准品引入的相对标准不确定度urel(ISp)

计算同3.1.1.1。

3.3.1.2 标准品称量产生的相对标准不确定度urel(ISm)

计算同3.1.1.2。

3.3.1.3 正丁基异硫氰酸酯内标溶液配制过程中器量校准引起的相对标准不确定度urel(ISV2)

本次标液配制使用了100、50 mL容量瓶和10 mL单标线吸量管，由使用容量瓶、单标线吸量管引起的体积相对标准不确定度为：

配制正丁基异硫氰酸酯内标溶液产生的相对不确定度为：

=0.60%

3.3.2 加入内标溶液吸量管引入的相对标准不确定度urel(V2)

加入内标溶液使用10 mL单标线吸量管引入的不确定度为：

因此，添加正丁基异硫氰酸酯内标溶液产生的相对不确定度为

3.4 样品含量重复测定产生的相对标准不确定度urel(Xrep)(测量不确定度A类评定)

样品混合均匀程度、仪器设备的分辨率和稳定性、实验人员操作技能等是影响测定结果的重要因素，样品含量重复测定的相对标准不确定度综合体现了样品均匀性、质量测量、体积测量、仪器测量中重复性的随机影响。按上述方法平行测定样品8次，测定结果及计算数据见表3。

表3 样品重复测量结果

样品重复测定产生的相对不确定度为：

因样品重复测定已考虑仪器的分辨率和稳定性，评定测量不确定度时不再另外计算仪器检测器给出的不确定度。

3.5 回收试验引入的相对标准不确定度urel(R)(测量不确定度A类评定)

分析方法的偏差通常是通过研究相关标准物质或通过加料研究而确定的，可以表示为分析回收率(观察值除以期望值)。分别完成1.0、2.0、10.0 mg 3个水平的添加，每个添加水平做2个重复，计算回收率，回收率范围为100.2%～105.5%，平均回收率为103.0%，结果见表4。

表4 样品回收率测定值

标准不确定度采用平均值的标准偏差：

=0.82

加标回收试验产生的相对测量不确定度为：

显著性检测是用来确定平均回收率是否与1.0有显著性差异。用t-检验(σ未知)确定加标平均回收率与1.0有无显著性差异，设显著水平为α=0.05，t1-0.05(n-1)=1.943(n=6)。

平均回收率与1.0差异显著，因此必须考虑方法回收率引入的不确定度。

4 合成标准不确定度、扩展不确定度计算和测量不确定度报告

4.1 计算合成标准不确定度

ucrel(X)=

=2.20%

合成标准不确定度为：

uc(X)=ucrel(X)×X=2.2 mg/kg。

4.2 计算扩展不确定度

不确定度各分量按正态分布处理，取包含因子k=2，包含概率p=95%，扩展不确定度为：

U=k×uc(X)=4.4 mg/kg。

4.3 测量不确定度报告

菜粕中的丙烯基异硫氰酸酯含量测定结果为：

X=(99.2±4.4)mg/kg，k=2。

5 讨论和结论

5.1 讨论

将各不确定度分量值按比例绘成图1，从图1可以看出，校正因子测定引入的不确定度分量对总不确定度的贡献最大，样品重复测定、回收试验和内标溶液带来的不确定度分量也不容忽视，提醒试验人员完成检测时，注意通过提高样品的均匀性、试验操作技能、仪器的分辨率等，可降低相关不确定度分量。另外，试样称量对总不确定度的贡献最小，说明使用分度值为0.000 1 g的天平，完全能够满足本试验的精度要求。

图1 测量不确定度分量分布示意图

5.2 结论

通过建立测定过程中各分量的数学模型，分析、识别了不确定度来源，其不确定度主要来源于校正因子、样品称量、正丁基异硫氰酸酯内标溶液添加、样品重复测定、回收率等因素。在对各不确定度分量进行量化的基础上，合成得到了测定结果的标准不确定度。当菜粕的丙烯基异硫氰酸酯含量为99.2 mg/kg时，得到其合成标准不确定度和扩展不确定度分别为2.2mg/kg和4.4 mg/kg。结果表明，校正因子测定引入的不确定度分量对合成标准不确定度的贡献最大，样品重复测定、回收试验和添加内标溶液带来的不确定度分量也不容忽视，试样称量对总不确定度的贡献最小，提醒试验人员完成检测时，注意通过提高样品的均匀性、试验操作技能、仪器的分辨率等，可降低相关不确定度分量，为采用该方法测定菜籽饼粕中异硫氰酸酯含量的质量控制提供了理论依据。

[1]ISO/IEC.Guide 98-3-2008 Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement [S]

[2]GB/T 13078—2001，饲料卫生标准[S]

[3]GB/T 13087—1996，饲料中的异硫氰酸酯的测定方法[S]

[4]Schramm K,Vassão D G,Reichelt M,et al.Metabolism of glucosinolate-derived isothiocyanates to glutathioneconjugates in generalist lepidopteran herbivores[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，2012(42):174-182

[5]Gu Zhenxin，Guo Qianghui,Gu Yingjuan.Factors influencing glucoraphanin and sulforaphane formation inBrassicaplants：a review[J].Journal of Integrative Agriculture，2012，11(11):1804-1816

[6]姜子涛，张清峰，李荣.异硫氰酸酯的产生、化学性质及测定方法[J].中国调味品，2005(4)：9-14

[7]潘雷，李爱科，程茂基，等.菜籽饼粕中硫甙降解产物定量检测方法研究进展[J].中国油脂，2009，34(6)：70-74

[8]CNAS-GL05—2011，测量不确定度要求的实施指南[S]

[9]CNAS-GL06—2006，化学分析中不确定度的评估指南[S]

[10]JJG 196—2006，《常用玻璃量器检定规程》[S].

Uncertainty Evaluation of Determination of Allyl Isothiocyanate in Rapeseed Meal with Gas Chromatography by Internal Standard Method

Zhang Fengping1, 2Du Xueli1Zhao Yan1Li Yingdong Liu Yaomin1
(Tongwei Co. Ltd.1, Chengdu 610041)(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University2, Shanghai 201306)

In the paper, the measurement uncertainty of determination on allyl isothiocyanate in rapeseed meal by gas chromatography internal standard method has been evaluated. The measurement models of each component in the process were established. The main sources of uncertainty have been analyzed and identified. The impact of every uncertainty component for the measurement uncertainty was estimated. Based on the quantitative analysis of each source, the relative standard uncertainty of measurement result was finally obtained as: the determination result of allyl isothiocyanate content in rapeseed meal 99.2 mg/kg; the combined standard measurement uncertainty and expanded one as 2.2 and 4.4 mg/kg respectively. The evaluation indicated that the correction factor was the reason which had made the most contribution to the relatively combined standard measurement uncertainty. The influence of repetitive test, the spike recovery a well as internal standard solution could not be neglected. The effect of sample weight was minimal. This evaluation has provided a theoretical basis for the quality control on allyl isothiocyanate content determination of rapeseed meal.

measurement uncertainty evaluation, gas chromatography,intemal standard method, allyl isothiocyanate, rapeseed meal

S816.2

A

1003-0174(2014)06-0112-06

四川省科技支撑计划(2011NZ0071)

2013-06-20

张凤枰，男，1972年出生，高级工程师，食品营养评价和质量安全检测