哈茨木霉在不同条件下菌丝生长和产孢情况研究

文/周洪岩

内蒙古扎兰屯林业学校 内蒙古兴安盟 162650

优化木霉( Trichoderum spp.)被认为是最有希望的生物防治因子。据统计全世界25个国家和美国 43个州的生物防治课题中，大约34%是有关木霉的研究。木霉属中应用最多的为哈茨木霉( T. harziarum)，常用剂型为麦麸制剂。哈茨木霉一般先通过PDA培养基进行一级培养后，再将孢子洗脱后植入麦麸中进行二级培养，因而其培养周期长、成本高。在一定程度上一级培养技术制约了哈茨木霉的规模生产。近年来，液体培养技术在微生物培养中应用较多，有关哈茨木霉液体培养技术的文献对木霉液体培养技术作了些探讨和实践，表明哈茨木霉液体培养技术具有培养周期短、孢子产量大、工业化程度高等优点，完全可以在一级培养中代替PDA 固体培养 ，这为哈茨木霉进行大规模工业化生产突破了关键的一环；同时也为冬虫夏草头孢发酵过程中所排放的废液找到了生物利用的出路，减少了对环境所产生的污染，并为其他类似微生物培养废液的生物利用提供了一条综合开发的思路，具有较强的实用价值。

1 试验材料和方法

1.1 菌种来源

哈茨木霉菌株是分离自实验室栽培食用菌灰树花时染菌的菌袋，由于当时观察到该菌株生长速度极快，很快覆盖了被污染的灰树花菌丝，并迅速长满菌袋，因此判断可能成为较好的生物防治菌剂来源，遂对其进行了分离。

1.2 主要试剂

PDB培养液：马铃薯（去皮200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL）。

1.3 主要仪器设备

医用型洁净工作台（DL-CJ-1F，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司制造）；

人工气候箱 （HPG-400H，哈尔滨东联电子技术开发有限公司制造）；

智能气候培养箱（ZPQ-400，哈尔滨东拓科技开发有限公司制造）；

图1 不同温度7d的分生孢子产生情况

图2 不同温度7d的菌丝干重情况

图3 不同pH值7d时的产孢情况

图4 初始pH值对菌丝干重的影响

微量移液器（Finnplpette Theron Electron）；

冰箱(NABILA INDESIT) ；

微波炉（MZ-2270M, 海尔）；

光学显微镜（Motic B1SERIES，SYSTEM MICROSCOPES）；

高压灭菌锅（SANYO Autoclave MLS-3020，SANYO Electric Co. Ltd.，Made In Japan）；

架盘药物天平(HC-TP11-5，上海精科)；

摄影显微镜（Olympus BX51）。

1.4 试验方法

将在9cm PDA平板上生长7d的哈茨木霉菌（2号菌株）孢子，用无菌水10mL洗，用血球计数器调制成浓度为107cfu/mL的孢子悬浮液。

PDB培养液的制备：马铃薯（去皮200g），用纱布包裹加入盛有1000mL蒸馏水的煮锅中，煮沸20分钟后加入20g葡萄糖，搅拌至溶化，每250mL三角瓶中加入100mL PDB培养液。

接菌：将用高压灭菌锅灭菌的盛有PDB培养液的三角瓶，移液枪枪头等物品放入操净工作台，用移液枪吸取107个/mL浓度的孢子悬浮液接菌至三角瓶，吸取量根据需求而定。

1.4.1 不同温度对哈茨木霉生长的影响

每250mL三角瓶中加入100mL PDB培养液，分别在8、16、21、25、30℃恒温下静置培养，每处理3瓶，7d镜检分生孢子的产生情况，并称量菌丝干重。

1.4.2 不同pH对哈茨木霉生长的影响

以1mol/L HCl和1mol/L NaOH的溶液分别将三角瓶中的溶液pH调到2、4、6、8、10、12，接种后分别于25℃恒温条件下静置培养，每处理3瓶，7d镜检分生孢子的产生情况，并称量菌丝干重。

pH的调制：利用移液枪吸取一定量的HCl或者NaOH加入盛有PDB培养液的三角瓶中，用玻璃棒蘸取少许培养液点加在pH试纸上比对以确定配得所需pH值。

2 试验结果与分析

2.1 不同温度对哈茨木霉生长的影响

由表1、图1和图2可见，哈茨木霉在温度为25℃时产生分生孢子量最大，菌丝干重最小。而菌丝干重最大是在8℃，此时分生孢子量最小。

2.2 不同pH对哈茨木霉生长的影响

由表2、图3和图4可见，哈茨木霉在pH=6时产生分生孢子量最大，菌丝干重最小。而菌丝干重最大是在pH=12时，此时分生孢子量最小。

目前木霉菌剂的生产多为孢子制剂，为了今后大规模生产木霉菌剂，对哈茨木霉菌的液体发酵条件进行了初步研究。研究发现：哈茨木霉在温度为25℃时产生分生孢子量最大。而菌丝干重最大是在8℃，此情况下分生孢子量最小。在pH=6时分生孢子量最大，菌丝干重最小。而菌丝干重最大是在pH=12，此情况下分生孢子量最小。

虽然这只是实验室内的小规模实验，但对大规模发酵生产具有一定的指导意义。