芍药软肝合剂对荷H22肝癌小鼠免疫功能及VEGF、PCNA表达的影响*

孙 燕张爱琴郜飞宇

（1.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022；2.南京医科大学附属无锡人民医院，江苏 无锡214023）

·研究报告·

芍药软肝合剂对荷H22肝癌小鼠免疫功能及VEGF、PCNA表达的影响*

孙 燕1张爱琴1郜飞宇2

（1.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022；2.南京医科大学附属无锡人民医院，江苏 无锡214023）

目的观察芍药软肝合剂对H22肝癌小鼠免疫功能的影响，并初步探讨芍药软肝合剂对及VEGF、PCNA表达的影响。方法采用细胞接种的方法建立小鼠H22肝癌动物模型，随机分为正常组、模型组、环磷酰胺组、中药低、中、高剂量组，观察各组动物的整体情况，行免疫组化染色实验对肿瘤组织中VEGF、PCNA表达进行检测。结果1）成功建立小鼠H22肝癌动物模型；2）芍药软肝合剂提高荷瘤小鼠机体免疫功能；3）芍药软肝合剂能降低H22肝癌小鼠肿瘤组织中VEGF、PCNA的表达水平。结论芍药软肝合剂对H22荷瘤小鼠的胸腺、脾脏有保护作用，能提高荷瘤小鼠机体免疫功能。其能抑制荷瘤小鼠中VEGF、PCNA蛋白的表达，从而抑制肿瘤生长。

芍药软肝合剂 肝癌 免疫功能 VEGF PCNA

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一［1］，除传统手术切除及放、化疗等治疗方法外，中医中药治疗在肝癌的治疗中也发挥了重要的作用。芍药软肝合剂是浙江省肿瘤医院研制开发的中药内服制剂，具有解毒、止痛、消肿等功效，主要用于肝癌、肝硬化的辅助治疗，特别是对原发性肝癌有较好的疗效［2］，临床及实验研究均表明该方有较好的抗肝纤维化的作用，可改善肝脏血液循环，恢复肝细胞功能。本研究采用实验动物学、分子生物学等方法，研究中药组方芍药软肝合剂对H22肝癌移植瘤小鼠免疫功能及肿瘤组织中VEGF、PCNA指标表达的影响，以期阐明芍药软肝合剂在肝癌治疗中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物及瘤株 ICR小鼠72只，均4~6周龄，体质量（20±2）g，雌雄各半，购买并饲养于浙江中医药大学动物实验中心清洁级动物房。小鼠H22肝癌瘤株，由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 药物 芍药软肝合剂由白芍、白花蛇舌草、半枝莲、重楼、三叶青、鸡内金、青皮、陈皮、山楂、郁金、三棱、莪术、白茅根、焦栀子、金钱草、紫金牛、白毛藤、路路通、仙鹤草等多味中药组成，成人用量每日3次，每次30 mL，按《中药药理研究方法学》中折算小鼠低、中、高用量相应的芍药软肝合剂用量分别为0.2、0.4、0.8 mL，置4℃冰箱备用。注射用环磷酰胺（CTX）：200 mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号08091432；用灭菌生理盐水配制成2 mg/mL的稀释液，储存于4℃冰箱备用。

1.3 试剂 兔抗鼠VEGF单抗购自杭州达诚生物技术公司，Santa Cruz公司产品。PCNA鼠抗多克隆抗体：购自杭州达诚生物技术公司，Santa Cruz公司产品。抗体稀释液：博士德生物工程有限公司。SP免疫组织化学检测试剂盒及DAB显色盒均购自杭州达诚生物技术公司。

1.4 模型制备 取H22肝癌细胞株，接种于小鼠腹腔，待7 d后，选择其腹水饱满小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒鼠腹，抽取适量的乳白色腹水，用生理盐水稀释，配制成1×107/mL瘤细胞悬液，以每只0.2 mL将瘤细胞悬液接种于ICR小鼠右腋皮下，复制小鼠H22肝癌模型，整个操作过程控制在2 h之内，以保持瘤细胞的活性。

1.5 分组与方法 于接种后第2天（造模24 h后），将小鼠分为6组，每组12只，各组在给药在造模后第2天至第15天。正常组不作任何处理；模型组予生理盐水0.4mL灌胃，每日1次；环磷酰胺组予环磷酰胺注射液，剂量为20 mg/kg，腹腔注射，每日1次；中药低剂量组予芍药软肝合剂0.2 mL，灌胃，每日1次；中药中剂量组予芍药软肝合剂0.4 mL，灌胃，每日1次；中药高剂量组予芍药软肝合剂0.8 mL，灌胃，每日1次。

1.6 标本采集与检测 在停药24 h后，颈椎脱臼处死小鼠；取出瘤组织、脾、胸腺等组织，分析天平称重脾、胸腺。脾指数=脾质量（mg）/体质量（g）；胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）；取部分瘤组织瘤组织置于10%甲醛溶液中固定，经脱水后行石蜡包埋，常规切片，分别行VEGF、PCNA的免疫组化染色，结果检测于400倍光镜下观察每张切片中VEGF、PCNA的表达情况，选取着色最明显的视野予以采集图像，利用图像分析软件测其累积光密度值（IOD值），取积分光密度值大小表示染色强度，其数值越大表示阳性染色越强，其数值越小表示阳性染色越弱。

1.7 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件。计量资料以（±s）表示；多组间资料比较采用方差分析，结果之间多样本比较用F检验，两两比较用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组荷H22肝癌小鼠胸腺指数、脾指数比较 见表1。1）胸腺指数：与正常组比较，余5组胸腺指数均减小，模型组、环磷酰胺组、中药低剂量组、中药高剂量组有统计学差异有统计学意义（P＜0.05），中药中剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，中药中剂量组的胸腺指数较大，有非常显著性差异 （P＜0.01）。2）脾指数：与正常组比较，余五组脾指数均减小（P＜0.05），与模型组比较，中药中剂量组的脾指数增大（P＜0.01），中药各剂量组中，以中药中剂量组效果最明显。

表1 各组荷H22肝癌小鼠胸腺指数、脾指数比较（±s）

表1 各组荷H22肝癌小鼠胸腺指数、脾指数比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 n 胸腺指数 脾指数正常组 1 2 2 . 3 3 ± 0 . 4 7 8 . 6 0 ± 0 . 7 4模型组 1 1 1 . 6 1 ± 0 . 2 1**5 . 6 2 ± 2 . 4 1**环磷酰胺组 8 1 . 7 2 ± 0 . 4 7**5 . 8 9 ± 1 . 6 6**中药低剂量组 9 1 . 9 2 ± 0 . 2 9*△6 . 1 2 ± 4 . 2 4*△中药中剂量组 1 1 2 . 2 3 ± 0 . 4 4△△7 . 5 6 ± 3 . 9 3*△△中药高剂量组 1 0 1 . 8 9 ± 0 . 3 8*△6 . 3 1 ± 4 . 7 3*△

2.2 各组荷H22肝癌小鼠肿瘤组织VEGF表达比较见表2。镜下可见，VEGF阳性表达见于癌细胞胞膜及胞质，棕黄色，呈灶性分布。结果表明，与模型组相比，环磷酰胺组及中药各剂量组的VEGF表达水平均有所降低（P＜0.05），其中环磷酰胺组及中药中剂量组下降最为明显，与模型组相比差异有统计学意义 （P＜0.01），但中药中剂量组与环磷酰胺组相比没有统计学意义（P＞0.05），中药低剂量组及高剂量组与环磷酰胺组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组荷H22肝癌小鼠肿瘤组织VEGF表达比较（±s）

表2 各组荷H22肝癌小鼠肿瘤组织VEGF表达比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与环磷酰胺组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别 n I O D值模型组 1 1 4 0 6 6 7 8 . 2 5 ± 3 5 5 7 3 . 2 3环磷酰胺组 8 2 9 5 1 9 3 . 4 0 ± 3 8 1 0 5 . 6 6**中药低剂量组 9 3 6 7 4 8 9 . 9 3 ± 8 7 8 9 5 . 9 7*△中药中剂量组 1 1 3 2 2 9 7 9 . 8 0 ± 5 8 3 2 2 . 4 3**中药高剂量组 1 0 3 5 0 8 7 7 . 7 8 ± 2 7 4 4 0 . 9 6*△

2.3 各组荷H22肝癌小鼠肿瘤组织PCNA表达比较见表3。镜下PCNA阳性表达为细胞核膜周围及核内被染成棕黄色，呈颗粒状或者弥漫样。单因素方差分析表明，与模型组相比，环磷酰胺组及中药各剂量组的PCNA表达水平均有所降低，除中药低剂量组与模型组相比差异无统计学意义（P>0.05），其他均都有统计学意义（P＜0.05），其中环磷酰胺组及中药中剂量组降低最为明显，与模型组相比差异有统计学意义 （P＜0.01）。与环磷酰胺组相比，中药中剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），中药低剂量组及中药高剂量组与环磷酰胺组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组荷H22肝癌小鼠肿瘤组织PCNA表达比较（±s）

表3 各组荷H22肝癌小鼠肿瘤组织PCNA表达比较（±s）

组别 n I O D值模型组 1 1 3 1 3 8 7 8 . 2 4 ± 3 0 6 8 4 . 1 6环磷酰胺组 8 2 4 4 8 5 4 . 7 6 ± 1 5 1 6 5 . 0 8**中药低剂量组 9 3 0 6 2 4 1 . 9 6 ± 8 7 1 9 3 . 9 7△△中药中剂量组 1 1 2 5 3 7 1 8 . 8 1 ± 2 9 4 3 8 . 1 8**中药高剂量组 1 0 2 7 1 4 6 7 . 2 3 ± 3 2 4 5 9 . 9 6*△

3 讨 论

根据临床表现，肝癌大致属于中医学“肝积”、“肥气”、“肝著”、“积聚”、“癥瘕”、“鼓胀”等范畴。本院院内制剂芍药软肝合剂方中炒白芍柔肝以顺其性，白花蛇舌草、半枝莲、三叶青、白毛藤、重楼清热解毒、消肿散结兼以内清相火，白茅根、金钱草消肿利尿，三棱、莪术具有行气破血、祛瘀消积等功能，郁金佐白芍，可起行气解郁、柔肝利胆功效，陈皮、青皮理气降逆、调畅气机，焦山楂、鸡内金消积滞、健脾胃，此方切合肝癌气滞血瘀、痰凝、毒聚相互交结的病理变化［3］，且符合肝为刚脏，内藏相火，体阴而用阳的肝脏中医生理特性。

肿瘤的发生和发展与机体的免疫功能下调或失控密切相关。胸腺和脾脏是机体极其重要的免疫器官，胸腺指数和脾脏指数的大小可以直接反映机体免疫水平的高低［4-5］，而现代医学也认为在恶性肿瘤防治过程中，增强机体免疫功能是疾病治疗的一个重要策略［6］，所以本实验观察各组用药后对移植瘤小鼠脾脏和胸腺的影响，具有重要的意义。本实验结果说明芍药软肝合剂对H22肝癌小鼠的免疫器官有一定的保护作用，以中剂量组效果最好。芍药软肝合剂可能是通过增强荷瘤小鼠的免疫功能，调控机体的防御机制，从而起到抑制肿瘤生长的作用。

另外，为了证实芍药软肝合剂的抗癌机制，本实验检测了荷H22小鼠的VEGF和PCNA的表达情况。VEGF是最有效的促血管生成促进因子，目前有研究表明抗肿瘤的机制之一主要就是通过阻断血管内皮生长因子及其主要受体（VEGFR）来达到抑制肿瘤新生血管形成［7］。多项临床试验结果均表明，VEGF及其受体在肝癌组织中较正常肝组织呈过高表达，并且肝癌细胞的VEGF表达程度还与患者的预后 （尤其是生存期）密切相关［8-9］。增殖细胞核抗原（PCNA）又称周期素，主要存在于增殖细胞核中，在DNA复制、细胞增殖和细胞周期调控中发挥重要作用，研究发现PCNA与细胞DNA合成关系密切，其量的变化可作为评价细胞增殖状态的一个良好指标。王东等［10］应用免疫组化检测了80例手术切除HCC组织PCNA的表达，结果发现肝癌组织PCNA表达较高，且表达水平与肝癌大小、组织学分级、核分裂相计数和转移密切相关，也证实了PCNA可能是反映肝癌侵袭能力的一项重要指标。本实验免疫组化检测可见，模型组中VEGF及PCNA表达最多，用药组VEGF及PCNA表达明显减少，其中环磷酰胺组与中药中剂量组效果最为显著 （与模型组比较P＜0.01）。提示芍药软肝合剂可减少小鼠肝癌移植瘤VEGF及PCNA的表达，说明芍药软肝合剂在一定程度上能够抑制肝癌新生血管生成和肿瘤细胞活性，从而抑制了肿瘤细胞增殖。

［1］ 陈万青，张思维，郑荣寿，等．中国2009年恶性肿瘤发病和死亡分析［J］．中国肿瘤，2013，22（1）：2-12．

［2］ 王奇，王春雷，侯桂兰.芍药软肝合剂的制备及临床应用［J］.江西中医药，2006，5（2）：281．

［3］ 刘应柯，祁广生，刘雪华．疏肝健脾和胃法为主治疗晚期原发性肝癌24例［J］．中医研究，2006，19（1）：29-31．

［4］ 邵世祥，王子鑫，毕磊．五倍子散配合华蟾素注射液治疗原发性肝癌51例［J］．实用中医内科杂志，2006，20（1）：93．

［5］ 陈洪国，杜晓军．内外合治中晚期肝癌30例［J］．山西中医，2005，21（5）：15-16．

［6］ 莫钦国.原发性肝癌以外科为主的综合治疗研究进展［J］.广西医学，2004，26（1）：58．

［7］ 张鑫．中西医结合治疗肝痛术后腹泻［J］．中西医结合肝病杂志，2002，12（5）：306-307．

［8］ 潘宏铭，徐农等．肿瘤内科诊治策略［M］．上海：上海科学技术出版社，2002：318．

［9］ 邓国忠，伍显庭，李国友，等.放疗加参苓汤治疗56例中晚期肝癌的临床观察［J］.四川中医，2004，22（1）：38-39．

［10］张岳正，吕爱林．中医辨证配合介入疗法治疗中晚期肝癌30例［J］．陕西中医，2004，25（9）：774-775．

Immune Effect of Shaoyao Ruangan Recipe on Hepatocarcinoma in Tumor-bearing H22 mice and Its Ef-fect on VEGF and PCNA Expression

SUN Yan，ZHANG Aiqin，GAO Feiyu.Zhejing Cancer Hospital，Zhejing，Hangzhou 310022，China

Objective：To observe the immune effec of Shaoyao Ruangan Recipe on hepatocarcinoma H22 tumor-bearing mice and to preliminary discuss the express influence of Shaoyao Ruangan Recipe to Proteins such as VEGF、PCNA and In order to clarify the Mechanism of Hepatocellular Carcinoma with Shaoyao Ruangan Recipe.Methods：Animal models of H22 hepatic cancer with mice were built according to inoculate tumor cell. Mice were randomly divided into six groups such as the normal group，the model group，CTX group，low-dose，middle-dose and high-dose group of Shaoyao Ruangan Recipe.Observe the mices'overall condition.The tumor growth inhibition rate spleen index was determined separately.The tumor tissue were carried out by the immune dyeing experiment to determine the protein express of VEGF、PCNA in the tumor tissue.Results：1）The animal model of Hepatocarcinoma H22 Tumor-bearing Mice was set up successfully.2）Shaoyao Ruangan Recipe could improve the immunity of tumor-bearing mice.3）The middle-dose of Shaoyao Ruangan Recipe could reduce the expression of VEGF and PCNA.Conclusions：Shaoyao Ruangan Recipe can protect the spleen and thymus gland of tumor-bearing mice，also has the ability to increase the immunity of tumor-bearing micec.Its anti-tumor mechanism may relate to the control of VEGF、PCNA express in tumor-bearing mice.

Shaoyao Ruangan Recipe；Hepatic carcinoma；Immunity；VEGF、PCNA

R285.5

A

1004-745X（2015）04-0590-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.04.008

2015-02-11）

浙江省中医药科技计划项目（2010ZA007）