基于微波辐照的高效固氮微生物诱变育种概述

李剑峰 张淑卿 杜建雄 韩晗 王镒宏

(1.贵州师范学院喀斯特生境土壤与环境生物修复研究所,贵州贵阳 550018;2.贵州财经大学,贵州贵阳 550025)

基于微波辐照的高效固氮微生物诱变育种概述

李剑峰1张淑卿1杜建雄2*韩晗1王镒宏1

(1.贵州师范学院喀斯特生境土壤与环境生物修复研究所,贵州贵阳 550018;2.贵州财经大学,贵州贵阳 550025)

采用2400～2500MHz、中心波长为122mm的微波对固氮微生物培养液进行辐照处理。利用特定波长的微波对某些特定DNA片段的诱变作用,诱发固氮菌株固氮能力的变异。以无氮培养基筛选突变株并进行菌株固氮酶活性的测定,通过对突变株的多代定向选择,选育出固氮能力强于原始株的稳定高效突变株。与紫外线诱变、化学诱变等诱变方式相比较,具有安全清洁、设备简单、廉价高效的特点,可以提高固氮微生物的育种效率和降低育种成本。

固氮菌 诱变育种 微波辐照 突变株 原始菌株

以固氮微生物制成的微生物促生肥料已广泛应用于农业生产中,在有效氮较低的耕作土壤内增产效果达22.1%～34%。我国固氮菌肥的应用已近半个世纪,取得了良好的效益。作为固氮菌肥料生产和应用的基础,高效固氮菌株的选育是固氮菌剂研发最重要的步骤。但野生固氮菌株的固氮能力一般较弱,进行增效诱变可获得高效固氮的突变菌株。目前诱变选育常采用紫外线辐照诱变、化学诱变等方法,其缺陷在于可能会对操作人员造成严重伤害,且选育出的菌株易产生回复突变,遗传性状不稳定[1]。而高能粒子束及激光束诱变则成本较高,效果也受设备条件和人员技术水平的影响,优良菌株的选育效率受到限制和弱化。因此如何提高固氮微生物的选育效率是科研机构和菌剂研发部门研究的重点。本文针对现有技术中的上述缺陷,介绍一种安全清洁、设备简单、廉价高效的固氮微生物诱变育种方法,可以提高固氮微生物的育种效率和降低育种成本[2]。

1 方案简介

1.1 辐照处理

固氮微生物的诱变处理:2400～2500MHz、中心波长122mm的微波对固氮微生物的培养菌液(OD600nm=0.5)进行微波辐照处理(根据菌种不同,辐照功率为100W-1050W,照射时间5s-240s不等),以正突变率最高的功率和时间为菌株的最佳辐照参数。

1.2 无氮培养基的配制

培养基母液配制[3]:KH2PO4(50.0 g/L),MgSO47H2O(25.0g/L),NaCl(25.0g/L),FeSO47H2O(1.0g/L),Na2MoO42H2O(1.0g/L),MnSO44H2O(1.0g/L),加1L H2O溶解后以1M NaOH调节pH为7.2,5ml培养基母液以10 g/L的甘露醇溶液定容至1L,加CaCO3粉末(0.1g/L),以2M H2SO4调pH值为6.2。固体培养基经0.45μm的微孔滤膜过滤后加琼脂15g/L,调节pH为6.8后高压湿热灭菌。

2 定向筛选

在最佳辐照参数处理后的根瘤菌(800W,12s)、圆褐固氮菌(150W,178s或100W,240s)、克雷伯氏菌(250W,36s)和红豆草根瘤菌(1050W,5s)等的菌悬液(1·104cfu.ml-1)0.2ml涂布于Winogradsky无氮固体培养基上[3]。培养7d(根瘤菌)或5d(圆褐固氮菌等)后选单菌落直径明显大于原始菌株的突变株,用乙炔还原法定量测定纯培养物的固氮酶活性,筛选固氮酶活性明显高于原始菌株的突变株作为初选菌株,进行进一步肥效验证。

3 肥效验证

将筛选出的突变株菌液施入栽培植物根部以验证突变株的促生效果,非结瘤固氮菌接种燕麦等禾本科作物;根瘤菌接种相应的宿主植物。对固氮酶活性和植物促生效果均显著强于出发菌株的突变株进行传代试验以测定其遗传稳定性,得到固氮促生能力稳定遗传的菌株。

4 菌种选育结果

对克雷伯氏菌(Klebsiella sp.),微波辐照的最佳参数为250W,36s。而对于红豆草根瘤菌则为1050W,5s,不同的固氮微生物在特定辐照功率和照射时间下均可达到其最高正突变率[3]。以辐照诱变方法获得的菌株固氮酶活性增效最高达3884.01%[4]。诱导出的高效固氮菌突变株对燕麦干重的增加量可达36.43%,较原始菌株提高137.10%,对苜蓿干重的增加量达58.54%,较原始菌株提高90.50%。对红豆草干重的增加量达35.96%,较原始菌株提高111.76%[4]。统计分析表明,高效突变株的固氮酶活性和对植株干重的增加量显著高出原始菌株(P＜0.05)。

5 讨论与结论

目前促生微生物菌种的诱变主要采用紫外辐照、化学诱变、高能粒子束及高能电子束辐照等方法,其原理都是破坏菌体原有DNA结构和碱基序列,在其重组修复的过程中产生可遗传的变异。紫外线和化学诱变设计的药品对人体有强致癌性,高能粒子束辐照相对安全,但超过剂量会出现次生放射性[5]。此外高能粒子束辐照的设备昂贵,仅能在少数有条件的单位完成。相比之下微波辐照诱变选育不存在次生放射性和化学残留,设备廉价易得,操作简单安全,育种效率高[5],有很好的实用性和可靠性。

[1]陈力力,鲁迎新.微波诱变育种井冈霉素高产菌[J].生物技术,2003,13(5):14-15.

[2]李剑峰,师尚礼,张淑卿等.一种高效固氮微生物诱变育种方法[P].甘肃:CN101899430A,2010-12-01.

[3]李剑峰,张淑卿,师尚礼,等.微波诱变选育耐药高效溶磷苜蓿根瘤菌[J].原子能科学技术,2009b,43(12):1071-1076.

[4]李剑峰,张淑卿,师尚礼.微波诱变选育高产生长素及耐药性根瘤菌株[J].核农学报,2009c,23(6):981-985.

[5]颜贤存,余莉莉,张凤英.微波对枯草芽孢杆菌诱变效应的研究[J].江西农业大学学报,2005,27(6):857-860.

贵州师范学院博士基金(13BS019)项目资助。

李剑峰(1979-),男,甘肃天水人,博士,副教授,从事植物促生菌剂方面的研究。

张淑卿(1982-),女,甘肃民勤人,博士,副教授,主要从内生菌方面的研究。