一步法制备羧基聚苯乙烯共聚荧光微球及其表征*

刘清浩，郭金春，段 鹏，刘红彦，陈立功

（1.中北大学 化工与环境学院，山西 太原 030051；2.河南省农业科学院植物保护研究所，河南 郑州 450002；3.天津大学 化工学院，天津300072）

一步法制备羧基聚苯乙烯共聚荧光微球及其表征*

刘清浩1，郭金春1，段 鹏1，刘红彦2，陈立功3

（1.中北大学 化工与环境学院，山西 太原 030051；2.河南省农业科学院植物保护研究所，河南 郑州 450002；3.天津大学 化工学院，天津300072）

以苯乙烯和丙烯酸/甲基丙烯酸为单体、烯丙基荧光素为荧光染料，采用一步法制备了两种粒径均一、表面羧基化的聚苯乙烯共聚荧光微球。用环境扫描电子显微镜、荧光显微镜、红外光谱仪、荧光分光光度计等对其形貌、结构和性能进行表征。结果表明:所制备的两种羧基化共聚荧光微球单分散性好、荧光性能好且稳定；表面成功引入羧基；聚合在共聚荧光微球中的荧光素具有和烯丙基荧光素一致的性质，并证实了共聚荧光微球和烯丙基荧光素在乙醇和甲苯中具有不同荧光光谱的理论。

丙烯酸；甲基丙烯酸；一步法；羧基聚苯乙烯共聚荧光微球

前言

羧基化聚苯乙烯微球具有分散性好、比表面积大、吸附性强、凝集作用大和与各种配体尤其是对生物分子的反应活性高等特性，以及其他性状如中空多孔性、磁性、荧光性等[1,2]，在免疫技术、蛋白质分析、临床诊断、细胞学等方面应用广泛[3～5]。将羧基化聚苯乙烯微球与荧光物质相结合得到羧基化聚苯乙烯荧光微球，其稳定的形态结构及高效的发光效率，已被应用于生物医学领域的检测中[6～8]。国内目前对荧光微球的研究多局限于专利[9,10]，且荧光稳定性差、易脱落、影响生物样品、量子效率不高的缺陷存在于各种制备技术之中；所用的荧光微球多依赖于进口[11,12]，价格昂贵，由此荧光微球的国产化已迫在眉睫，这也必将大大推动生物科学技术的发展。以烯丙基荧光素为荧光染料，采用一步法-分散聚合制备了羧基聚苯乙烯共聚荧光微球，并研究了微球的形貌和光谱性能。在本实验中，采用带有可聚合基团的烯丙基荧光素与苯乙烯直接聚合，制备的羧基聚苯乙烯共聚荧光微球具有稳定和宽的光谱范围，且微球表面带有羧基功能基团，便于后续生物学的应用。

1 实验部分

1.1 主要试剂

苯乙烯（St，减压蒸馏）、偶氮二异丁腈（AIBN，重结晶）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K30）、无水乙醇（EtOH）、丙烯酸（AA，重结晶）、甲基丙烯酸（MAA，重结晶）、3-溴丙烯和荧光素（Flu）均为分析纯。实验用水均经离子交换并二次蒸馏纯化。

1.2 烯丙基荧光素的合成[13]

向装有电磁搅拌的100mL四口瓶中加入荧光素2.00g（6.00mmol），3-溴丙烯2.42g（20.00mmol），无水碳酸钾4.97g（36.00mmol），对苯二酚（痕量），碘（痕量）和干燥的DMF（50mL）。在N2保护且避光的条件下，加热至回流（71℃）反应25h。减压蒸馏除去DMF，得黄色粗品，用氯仿重结晶后，干法上样经柱色谱（二氯甲烷，V/V）分离提纯得黄色粉末0.91g，收率40.53%。如图1所示。

图1 烯丙基荧光素的合成Fig.1 The synthesis of allyl fluorescein

1.3 一步法制备羧基聚苯乙烯共聚荧光微球

分别称取烯丙基荧光素适量、苯乙烯0.95mL、甲基丙烯酸或丙烯酸0.04mL、偶氮二异丁腈0.02g、聚乙烯吡咯烷酮0.06g、无水乙醇3.0g和水0.4g，置于微量反应器中，通氮除氧，密封，超声得澄清透明溶液。置于恒温振荡器中，在70℃，130rpm条件下，反应12h。用乙醇反复洗涤所得微球，50℃真空干燥即得羧基聚苯乙烯共聚荧光微球，避光保存。图2是一步法制备羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的反应历程图。

图2 一步法制备羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的反应历程Fig.2 The preparation of carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere by one step method

1.4 结构表征

羧基聚苯乙烯微球及其荧光微球的形貌通过在其表面均匀喷金后，分别利用JSM-6390型、SU-500型扫描电子显微镜（日本电子）表征。运用DM6000-B荧光显微镜（德国Leica）用绿光滤光片在630×和400×观察荧光微球的分散性和荧光的均一度。在拍荧光照片时荧光强度会随着时间的增加而衰减，最后湮灭，应尽量在荧光湮灭之前快速拍摄以保证测试结果的准确度。将所制备的羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯荧光微球分别与KBr混合压片后由岛津8400S FTIR光谱仪测定红外光谱。利用美国Varian公司生产的Cary Eclipse型荧光分光光度计和日本岛津UV2450紫外-可见分光光度计对荧光微球和烯丙基荧光素的光谱性能进行表征。

2 结果与讨论

2.1 羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的SEM形貌

图3（A）是采用丙烯酸单体制备的羧基聚苯乙烯微球的SEM图，粒径约为2 μ m。图3（C）是采用甲基丙烯酸单体制备的羧基聚苯乙烯微球的SEM图，粒径比较大，约为3.7μ m。在同样的实验条件下，加入相同量不同的单体（丙烯酸或甲基丙烯酸），却得到两种粒径的微球。原因是丙烯酸（AA）和甲基丙烯酸（MAA）均是水溶性单体，且丙烯酸比甲基丙烯酸的极性大，在本实验中含有丙烯酸分散介质的极性比含甲基丙烯酸分散介质的极性大，使P（St-AA）链比P（St-MAA）链在分散介质中的溶解度、沉淀的临界链长减小的多，使P（St-AA）比P（St-MAA）的成核粒子数目增多，粒径减小。

图3 羧基聚苯乙烯微球（A）和（C）和羧基聚苯乙烯共聚荧光微球（B）和（D）的SEM照片Fig.3 TheSEMimagesofcarboxylate-modifiedpolystyrenemicrospheres（A）（×6000）,（C）（×5000）and carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microspheres（B）（×6000）,（D）（×8000）

从图3（A）（C）可以看出，所制备的羧基聚苯乙烯微球粒径均一且单分散性好，这为制备羧基聚苯乙烯共聚荧光微球奠定了基础。图3（B）是采用丙烯酸单体制备的羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的SEM图，图3（D）是采用甲基丙烯酸单体制备的羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的SEM图。由图1可知，荧光染料烯丙基荧光素分子较大且有两个双键，在共聚过程中存在一定程度的空间位阻，具有自阻聚作用。但加入少量烯丙基荧光素，可以保证羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的粒径均一。从图3（B）（D）可以看出，羧基聚苯乙烯共聚荧光微球和羧基聚苯乙烯微球（A）（C）具有基本相同的粒径和分散性。

2.2 羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的荧光形貌

图4 羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的荧光照片Fig.4 Thefluorescentimagesofcarboxylate-modifiedpolystyrenecopolymerized fluorescent microsphere（A），（B）（×630）and（C）,（D）（×400）

图4是羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的荧光显微镜照片。由图（A）、（B）、（C）和（D）可以看出，荧光微球单分散性好，荧光物质在微球中均匀分布，使得微球发光效率高且很稳定，这将使其在以后的研究应用中能较好的发挥作用。

2.3 羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的红外光谱图

图5是羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的红外光谱图。在羧基聚苯乙烯微球的红外光谱图A中可以观察到，1702cm-1处为C=O基的伸缩振动峰，3446cm-1为羧酸中羟基的伸缩振动峰，说明微球表面羧基的存在；1489cm-1和1448cm-1处为苯环上C-C的伸缩振动峰，700cm-1和758cm-1为苯环上C-H键的面外弯曲振动峰，3019、3060和2921cm-1为苯环上不饱和C-H键的伸缩振动峰。上述红外光谱图A可证明成功的制备了羧基聚苯乙烯微球。比较羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的红外光谱图B和羧基聚苯乙烯微球的红外光谱图A，二者基本一样，这是由于荧光微球中烯丙基荧光素是共聚在微球内部且含量少，红外谱图不能表征出荧光染料的特征峰。

图5 羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯共聚荧光微球的红外光谱图Fig.5 The FT-IR spectrum of carboxylate-modified polystyrene microsphere and carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere

2.4 烯丙基荧光素的光谱图

图6为烯丙基荧光素和荧光素在0.1MNaOH溶液中的荧光和紫外-可见光谱图，将图中所示的最大吸收波长确定为测荧光时的激发波长。如图6所示，烯丙基荧光素在455和473nm处有两个吸收峰，且烯丙基荧光素紫外光谱图的宽度和其荧光光谱图的宽度是一致的，表明合成的烯丙基荧光素具有稳定和宽的光谱范围。在引入烯丙基后，和母体染料相比，烯丙基荧光素在0.1MNaOH溶液中的荧光光谱发生了红移。

图6 烯丙基荧光素和荧光素在0.1M NaOH溶液中的紫外-可见和荧光光谱Fig.6 The UV-vis and fluorescence spectra of allyl fluorescein and fluorescein in 0.1M NaOH solution（λex of ally fluorescent is 455nm and λex of fluorescein is 491nm）

2.5 羧基聚苯乙烯共聚荧光微球、烯丙基荧光素和M在四氢呋喃中的光谱图

图7 羧基聚苯乙烯共聚荧光微球，烯丙基荧光素和M在四氢呋喃中的紫外-可见光谱和荧光光谱（λex=455 nm）（1代表烯丙基荧光素的荧光微球；M代表和相应荧光微球等物质的量烯丙基染料和聚苯乙烯的混合物）Fig.7 The UV-vis spectra and fluorescence spectra of carboxylatemodified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere,allyl fluorescein and M in THF（λex=455nm）（1 is a representative of ally fluorescent microsphere;M is a representative of the mixture of allyl dye and polystyrene which has an equal amount of substance with fluorescent microsphere）

图7是羧基聚苯乙烯共聚荧光微球、烯丙基荧光素和M在四氢呋喃中的荧光和紫外-可见光谱图。由图可以看出，在四氢呋喃溶液中，它们有很相似的紫外和荧光光谱。上述结果表明烯丙基荧光素的染料特性在共聚荧光微球中保持不变，同时也证实微球的芳香环境或聚苯乙烯的刚性结构不影响烯丙基荧光素在四氢呋喃中的光谱性质。

2.6 羧基聚苯乙烯共聚荧光微球、烯丙基荧光素在乙醇或甲苯中的光谱图

图8是烯丙基荧光素在乙醇和甲苯中的荧光和紫外-可见光谱图（荧光微球分散在乙醇中的荧光光谱图）。由图可以看出，在乙醇溶液中荧光微球的荧光光谱相对于烯丙基荧光素出现了红移。为探究这种荧光光谱移动的原因，选择和聚苯乙烯具有同样芳香结构的甲苯作为溶剂，将烯丙基荧光素溶入甲苯测定其荧光光谱。

图8 烯丙基荧光素在乙醇和甲苯及相应荧光微球在乙醇中的光谱（1代表烯丙基荧光素在乙醇中，2代表烯丙基荧光素在甲苯中，3代表荧光微球在乙醇中。烯丙基荧光素λex-ethanol=458nm and λex-toluene=436nm；荧光微球λex=458nm）Fig.8 The fluorescence spectra and UV-vis spectra of allyl fluorescein in ethanol and toluene and the carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere dispersed in ethanol（1,2 is a representative of ally fluorescein in ethanol and in toluene respectively, and 3 is a representative of fluorescent microsphere in ethanol.λexethanol=458nm and λex-toluene=436nm for ally fluorescein and λex= 458nm for fluorescent microsphere)

图8表明相对于烯丙基荧光素在乙醇溶液中的荧光光谱，烯丙基荧光素在甲苯和荧光微球在乙醇溶液中的荧光光谱有不同程度的红移，这说明当荧光微球在乙醇溶液中，荧光光谱发生红移主要是芳香环境和聚苯乙烯基质的刚性结构造成的。

3 结论

（1）合成出光谱范围宽且具有可聚合基团的荧光染料烯丙基荧光素。

（2）采用丙烯酸或甲基丙烯酸为功能单体，一步法分别制备了2μm和3.7μ m的两种单分散性好、粒径均一、荧光发光效率较高且性能稳定的羧基聚苯乙烯共聚荧光微球。

（3）羧基聚苯乙烯共聚荧光微球上的羧基易与不同生物分子的氨基相结合，在生物医学方面有广泛的应用前景，尤其可应用到免疫检测等生物学研究中。

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图5 G2.0含量对体系弯曲强度的影响Fig.5 The effect of G2.0 content on the bending strength of G2.0－modified system

3 结论

本文以TMA为核，PCL2054为接枝单体，采用“准一步法”合成了端羧基超支化聚酯第二代产物G2.0并对其进行了表征，证明合成了目标产物。对G2.0改性环氧体系的性能测试表明，添加适量的G2.0可明显提高环氧体系的粘接性能，同时其固化物的拉伸性能和冲击强度都明显提高，改善效果明显。但聚酯含量过高，改性体系固化物弯曲强度下降明显。

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The Preparation of Carboxylate-modified Polystyrene Copolymerized Fluorescent Microspheres by One-step Method and Characterization

LIU Qing-hao1,2,GUO Jin-chun1,DUAN Peng1,LIU Hong-yan2and CHEN Li-gong3
（1.College of Chemical Engineering and Environment,North University of China,Taiyuan 030051,China;2.Institute of Plant Protection,Henan Academy of Agriculture Sciences,Zhengzhou 450002,China;3.College of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,
China）

Two kinds of carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microspheres with uniform particle size were synthesized by one step method with using allyl fluorescein as fluorescent dye,styrene and acrylic acid/methacrylic acid as monomer.The morphology,structure and performances of these fluorescent microspheres were characterized by environmental scanning electron microscopy,fluorescence microscopy,Fourier transform infrared spectrometer,fluorescence spectrophotometer,etc.The results indicated that these two kinds of fluorescent microspheres were obtained with good dispersity and stable and high fluorescence intensity.And the carboxyl groups were successfully introduced on the surface.Furthermore,the properties of fluorescein in copolymerized fluorescent microspheres remained the same as it was in the allyl fluorescein,and the theory of the copolymerized fluorescent microspheres and allyl fluorescein in ethanol and toluene having different fluorescence spectrum had been proved.

Acrylic acid;methacrylic acid;one step method;carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere

TB332；O63

A

1001-0017（2015）06-0429-05

2015-06-16 *基金项目：省级大学生创新创业训练项目（编号：1404211305）

刘清浩(1979-)，女，河南南阳人，讲师，博士，主要从事新型荧光功能材料合成、性能和生物应用的研究。