Toll 样受体在高迁移率族蛋白B1诱导严重烧伤后枯否细胞分泌促炎性细胞因子中的作用

陈旭林 孙 立 郭 峰 王 飞 刘 晟 梁 勋 王仁素 王永杰 孙业祥

（安徽医科大学第一附属医院烧伤科，安徽 合肥 230022）

高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）作为一个重要的促炎性细胞因子，被认为既是炎症早期的启动者，又是炎症晚期的促进者[1]，介导了严重烧伤的全身炎症反应过程，参与了烧伤后全身多脏器损伤的发生[2]，但其在促进烧伤后肝脏枯否细胞（Kupffer cells, KCs）表达促炎因子中的具体机制尚不清楚。HMGB1主要通过Toll样受体(TLRs)信号途径（特别是TLR2和TLR4）起到引起炎症反应的作用[3]。本文探讨TLRs在HMGB1诱导的严重烧伤大鼠KCs分泌促炎性细胞因子中的作用，以了解HMGB1促炎作用的受体机制。

1 材料和方法

1.1 动物分组与烧伤模型的制备 健康成年雄性SD大鼠32只，体重200～250 g，购自安徽医科大学动物中心。常温下饲养1周，随机分为烫伤组(n=24)和假烫组(n=8)。烫伤组大鼠以戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，背部置于98 ℃水中12 s，造成30%TBSA Ⅲ度烧伤，烧伤后立即给予乳酸林格液(30 ml/kg)腹腔注射进行液体复苏。假烫组大鼠进行相同的麻醉，但给予室温水浴，不行液体复苏。各组大鼠于烫伤或假烫后24 h心脏取血处死，分离肝脏KCs。

1.2 KCs的分离与培养 KCs的分离采用肝脏原位灌注，Nycodenz不连续密度梯度离心和选择性黏附法[4]。KCs活性的判断和鉴定分别采用台盼蓝染色和乳胶微粒吞噬试验，活性和纯度均大于95%。分离后的KCs以每孔1×106的密度接种于24孔板中。为观察HMGB1对烧伤后KCs促炎性细胞因子产生的影响，烫伤组和假烫组大鼠的KCs分别采用不同浓度HMGB1（0、50、100、200 ng/ml，美国Sigma公司）刺激48 h，然后测定细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β的含量。为了解HMGB1烧伤后促炎作用的受体机制，另将烫伤组大鼠的KCs分离后随机分为4组：①对照组，RPMI-1640培养液中培养48 h；②HMGB1组，100 ng/ml HMGB1 刺激48 h；③HMGB1+TLR2抗体组，20 μg/ml TLR2抗体（美国Invivogen公司）培养2 h后加入100 ng/ml HMGB1 刺激48 h；④HMGB1+TLR4抗体组, 20μg/ml TLR4抗体（美国Invivogen公司）培养2 h后加入100 ng/ml HMGB1 刺激48 h。检测各组KCs中TNF -α和IL-1β mRNA的表达。

1.3 ELISA法测定KCs上清液中的TNF-α和IL-1β含量 收集细胞培养上清液，使用大鼠TNF-α和IL-1β酶联免疫吸附试剂盒（美国Bio Source公司）检测TNF-α和IL-1β含量，相关操作按照生产商提供的说明书进行。

1.4 Northern blot法检测KCs中TNF -α和 IL-1β mRNA的表达 使用 Trizol法提取KCs的总RNA，测定260和280 nm处 吸光度值以反映RNA 含量和纯度。采用文献[5]的方法将提取的10 μg RNA电泳后，转移到尼龙膜（Hybond-N+，美国Amersham公司），得到的印记分别与(α-32P)d CTP(3000 Ci/mmol，美国Amersha公司）标记的大鼠TNF-α和IL-1β的c DNA探针相杂交，采用GAPDH作为内参照。杂交膜使用Phosphor-Imager成像系统进行吸光度分析。

2 结 果

2.1 HMGB1刺激后烧伤大鼠KCs 上清液TNF-α和IL-1β含量的变化 烫伤组和假烫组大鼠的KCs在HMGB1刺激后，上清液中的TNF-α 和IL-1β含量均明显升高，其升高幅度与HMGB1均呈现剂量依赖性关系。统计学结果显示：HMGB1刺激后，烫伤组大鼠KCs分泌的TNF-α和IL-1β水平显著高于假烫组大鼠的KCs（P＜0.05或P ＜0.01），这种差异在使用100 ng/ml或者更高浓度HMGB1刺激后更为明显。见表1。

2.2 Toll样受体在HMGB1刺激致KCs培养上清液中TNF-α和IL-1β含量变化中的作用100 ng/ml HMGB1刺激后烧伤大鼠KCs分泌TNF-α和IL-1β显著增加，TLR2/4抗体预培养KCs都可以明显减弱HMGB1诱导TNF-α和IL-1β上调的作用（P ＜0.01）。TLR4抗体抑制HMGB1诱导TNF-α表达的作用比TLR2抗体更明显（73%对53%，P ＜0.05），加入TLR4抗体预培养的KCs培养液上清中TNF-α水平与对照组之间差异无显著性（P ＞0.05）。TLR2抗体较TLR4抗体更显著地抑制了HMGB1诱导的IL-1β表达（79%对51%，P ＜0.05），HMGB1+TLR2组的KCs培养液上清中的IL-1β水平与对照组之间差异无显著性（P ＞0.05）。见表2。

表1 HMGB1刺激严重烫伤大鼠KCs后培养上清液中TNF-α 和IL-1β含量的变化（±s, n =8）

表1 HMGB1刺激严重烫伤大鼠KCs后培养上清液中TNF-α 和IL-1β含量的变化（±s, n =8）

注：与假烫组比较：* P ＜0.05，** P ＜0.01

HMGB 1 (ng/ml) TNF-α (ng/ml) IL-1β (ng/ml)假烫组 烫伤组 假烫组 烫伤组0 0.91±0.06 2.68±0.130 0.18±0.01 0.434±0.05000 50 1.75±0.16 4.41±0.43* 0.35±0.03 0.82±0.08*0 100 4.59±0.45 10.59±1.39** 0.85±0.09 2.49±0.33**200 8.04±0.76 18.69±1.98** 1.40±0.14 3.94±0.45**

表2 ELISA法检测各组大鼠KCs培养上清中TNF-α和IL-1β的含量（±s, n =8）

表2 ELISA法检测各组大鼠KCs培养上清中TNF-α和IL-1β的含量（±s, n =8）

注：与对照组比较：* P ＜0.05，** P ＜0.01；与 HMGB1 组比较 ：#P ＜0.05，##P ＜0.01

组 别 TNF-α (ng/ml) IL-1β (ng/ml)对照组 2.69±0.140 0.43±0.0500 HMGB1组 10.59±1.39** 2.49±0.33**HMGB1＋TLR2 抗体组 4.956±0.36*## 0.52±0.08##HMGB 1＋TLR4 抗体组 2.88±0.36## 1.21±0.21*##

2.3 TLRs在HMGB1诱导严重烧伤大鼠KCs TNF-α和 IL-1β mRNA 表 达 中 的 作 用Northern blot结果表明，100 ng/ml HMGB1刺 激 KCs 48 h后， 细 胞 内 TNF-α和 IL-1β m RNA水平均较对照组明显升高（P ＜0.01）。与HMGB1单独刺激组比较，使用TLR2/4抗体预培养严重烧伤大鼠KCs明显抑制HMGB1诱导的 TNF-α 和 IL-1β mRNA 表 达（P ＜0.01）。TLR2抗体抑制IL-1β m RNA表达的作用更为明显，而TLR4抗体抑制TNF-α mRNA表达的作用更为显著。

3 讨 论

枯否细胞存在于肝血窦中，是组成机体单核-巨噬细胞系统最大的群体，占单核-巨噬细胞总数的80%～90%。KCs是重度烧伤早期炎症因子TNF-α和IL-1β释放的重要来源，并且导致了烧伤后的肝损伤，抑制KCs的活化可以减轻烧伤后全身炎症反应的发生。

图1 Northern blot法检测各组大鼠KCs中TNF -α和IL-1β mRNA的表达

HMGB1是一种高度保守的非组蛋白染色体蛋白质，最初认为它是一种参与维护核小体结构和调节基因转录的DNA结合蛋白。HMGB1可由烧伤后损伤的细胞被动释放，也可由应激状态下的单核细胞和巨噬细胞主动分泌，是一种引起烧伤后组织损伤和炎症反应的介质。大面积烧伤患者血浆中HMGB1水平明显升高[6-7]。最新研究发现，HMGB1作为一种强有力的促炎性细胞因子和“晚期”炎症介质参与了全身炎症反应的进程[1]。在本研究中，虽然HMGB1能诱导各实验组KCs中TNF-α和IL-1β表达增高，但是严重烧伤大鼠来源的KCs对于HMGB1诱导的TNF-α和IL-1β表达比假烫组更敏感。HMGB1上调严重烧伤大鼠KCs表达TNF-α和IL-1β呈剂量依赖性的关系。这些结果表明HMGB1可能在烧伤后炎症反应级联放大过程中起到非常重要的作用。

由于100 ng/ml HMGB1上调严重烧伤大鼠KCs 分泌TNF-α和IL-1β的作用最为显著，故在探讨TLRs在HMGB1诱导严重烧伤后KCs促炎性细胞因子产生中的作用时，采用100 ng/ml HMGB1刺激KCs。

Toll样受体是一组高度保守的蛋白，接受各种内源性和外源性刺激后激活固有免疫细胞,在机体免疫应答中发挥着重要作用[8]。HMGB1主要通过Toll样受体信号途径（特别是TLR2和TLR4）起到引起炎症反应的作用[9-10]。本实验中用特异性阻断剂分别阻断TLR2和TLR4的表达，发现阻断TLR4的表达较阻断TLR2的表达能更有效地抑制HMGB1诱导KCs表达TNF-α。另一方面，阻断TLR2的表达比阻断TLR4的表达更显著地抑制了HMGB1诱导KCs表达IL-1β。本研究结果表明，HMGB1通过TLR2和TLR4介导KCs表 达 TNF-α和 IL-1β； TLR4在 HMGB1诱导KCs表达TNF-α的过程中起到更加重要的作用，而HMGB1诱导KCs表达IL-1β主要依靠TLR2介导。TLR2和TLR4在HMGB1诱导烧伤后KCs产生和释放炎性细胞因子的过程中发挥着不同作用。

除TLR2及TLR4外，Toll样受体家族中的TLR9和晚期糖基化终末产物受体(RAGE）同样可以被HMGB1激活[9,11]，但其激活在烧伤后HMGB1诱导的KCs活化及炎性细胞因子释放中的作用尚不明确。我们之前的研究发现使用RAGE抗体预培养的KCs并不能降低HMGB1诱导的TNF-α和IL-1β分泌，这意味着绝大多数HMGB1引起的烧伤KCs活化并不依赖RAGE。有关TLR9在严重烧伤后HMGB1介导的KCs激活及炎性细胞因子释放中的作用还有待于进一步研究。

［1］Andersson U, Tracey KJ. HMGB1 is a therapeutic target for sterile inflammation and infection[J]. Annu Rev Immunol, 2011,29:139-162.

［2］Liang X, Wang RS, Wang F, Liu S,Guo F, Sun L, Wang YJ, Sun YX, Chen XL, etal. Sodium butyrate protects against severe burninduced remote acute lung injury in rats[J]. PLoS One, 2013,8(7):e68786.

［3］Yang J, Chen L, Yang J. High mobility group box-1 induces migration of vascular smooth muscle cells via TLR4-dependent PI3K/Akt pathway activation[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(3):3361-3367.

［4］Chen XL, Xia ZF, Wei D. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in Kupffer cell secretion of the proinflammatory cytokines after burn trauma[J]. Burns 2003, 29(6):533-539.

［5］Jia YT, Ma B, Wei W. Sustained activation of nuclear factorkappaB by reactive oxygen species is involved in the pathogenesis of stress-induced gastric damage in rats[J]. Crit Care Med, 2007,35(6):1582-1591.

［6］Huang LF, Yao YM, Dong N. Association of high mobility group box-1 protein levels with sepsis and outcome of severely burned patients[J]. Cytokine, 2011, 53(1):29-34.

［7］Lantos J, Földi V, Roth E. Burn trauma induces early HMGB1 release in patients: its correlation with cytokines[J]. Shock, 2010,33(6):562-567.

［8］董宁,姚咏明.Toll样受体免疫学研究新进展[J]. 感染、炎症、修复, 2008, 9(3):177-180.

［9］Yang J, Chen L, Yang J. High mobility group box-1 induces migration of vascular smooth muscle cells via TLR4-dependent PI3K/Akt pathway activation[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(3):3361-3367.

［10］ 姚咏明, 刘辉.重视高迁移率族蛋白B1免疫效应的探索[J].感染、炎症、修复, 2009, 10(1):3-5.

［11］Mazarati A, Maroso M, Iori V, Vezzani A, Carli M, etal. Highmobility group box-1 impairs memory in mice through both toll-like receptor 4 and receptor for advanced glycation end products[J]. Exp Neurol, 2011, 232(2):143-148.