碱性成纤维细胞生长因子在构建组织工程脂肪中的应用

田亚菲， 刘 毅

碱性成纤维细胞生长因子在构建组织工程脂肪中的应用

田亚菲， 刘 毅

脂肪组织工程; 碱性成纤维细胞； 生长因子

生长因子对细胞的黏附、生长、增殖、迁移、分化、基因表达等多方面起着重要的调控作用，是构建组织工程脂肪的重要一环。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)因具有明显的促进组织血管化、干细胞增殖和成脂分化作用，在脂肪组织工程领域是一种比较理想的生长因子。笔者现就bFGF在脂肪组织工程中的应用作一综述。

1 bFGF的发现及生物学效应

bFGF是由D Gospodarowiz 等于1974年在牛脑垂体中分离纯化，因其对成纤维细胞系Balb/c3T3具有促有丝分裂、增殖效应，且等电点为9.6而得名。bFGF是一种内源性多肽生长因子，在促进血管新生、细胞分裂及生长等方面，有强烈的生物活性。虽然人体内含量甚微，但生理作用相当广泛，对中胚层和神经外胚层来源的细胞(纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞、骨骼肌细胞、造血干细胞、神经干细胞[1]、胚胎干细胞[2]等)，有较强的促有丝分裂和分化[3]作用，是一种高效的细胞生长调节因子。此外，bFGF 还参与调控体内血管新生的整个过程，其对新生血管形成过程中，毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成、小血管腔状结构的形成，进而新生血管等均有明显的促进作用[4]。总之，bFGF具有趋化和促进细胞增殖、迁移、分化，促进组织创伤愈合，修复软硬组织，促进胚胎发育、血管形成等多种生物学效能[5]。

2 bFGF促干细胞增殖分化作用

bFGF是公认的具有诱导趋化、促有丝分裂的生长因子，在分化早期，对间充质干细胞的增殖分化起着非常重要的作用。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有自我更新、增殖及多向分化的潜能，可分化为 3个胚层来源的多种组织细胞(Y Jiang, 2002年)，是脂肪组织工程理想的种子细胞之一。研究发现，bFGF具有很强的促细胞增殖效应，可借助参与激活细胞外信号，调节激酶(Erkl/2)信号通路，进而促进细胞增殖[6]，故bFGF可作为扩增种子细胞BMSCs的有效方法[7]。黄桂玲和邓宇[8]研究发现，bFGF在低浓度(1 μg/L)下能够显著促进BMSCs增殖，并保持其稳定的未分化状态，这种优化的扩增方法将使BMSCs在用于脂肪组织工程方面具有更好的前景。Song等[9]将胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESCs)诱导为BMSCs后进行成脂诱导，添加4 ng/ml bFGF成脂诱导剂的脂肪细胞形成显著高于未添加组，提示bFGF在脂肪细胞分化中发挥着重要的作用。

脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是由PA Zuk等(2001年)在抽脂术后，从脂肪组织废弃液分离出的血管基质成分中发现并获取的干细胞。ADSCs是一种具有和BMSCs相近的生物学特性和免疫表型的干细胞[10]，ADSCs因具有取材方便、易于获取、可多向分化等诸多优点，使其成为脂肪组织工程理想的种子细胞之一[11]。徐扬阳等[12]将不同浓度的重组人bFGF加入ADSCs的成脂诱导剂中，发现 rh-bFGF能有效促进ADSCs的增殖速率，加速ADSCs向脂肪细胞的分化，且40 ng/ml为其最佳浓度。可见，bFGF对成脂干细胞的增殖率、新形成脂滴的时间以及成熟脂肪细胞的蛋白表达，均有正向调节作用，也是脂肪组织工程良好的细胞因子。

3 bFGF的血管化作用

脂肪移植后的吸收问题一直困扰着临床应用，使其实施受到一定的限制。造成移植脂肪吸收的主要机制是由于脂肪细胞间质较少，且易受损伤，移植后手术操作对脂肪细胞造成的损伤，血供的中断及细胞营养的匮乏，使细胞随之坏死、自溶、吸收，并由纤维组织替代，所以脂肪移植首要考虑的解决方案就是重建血液循环。bFGF可通过激活Akt/MMP-2信号通路等多种机制显著诱导血管生成。 Monti等[13]发现，激活PKCε可显著促进内皮细胞分泌bFGF，而bFGF可上调VEGF受体的表达，进而促进血管新生。自体脂肪移植手术中加用bFGF，可以显著提高自体脂肪的成活率，因为在移植的早期，bFGF可促进细胞增殖并维持细胞活力，而且能激活脂肪组织中的前脂肪细胞，使之转化为成熟的脂肪细胞，从而促进移植脂肪血管生成[14]。所以，将bFGF用于自体脂肪移植术可取得良好的临床效果[15]。

在以ADSCs结合bFGF辅助颗粒脂肪移植中，蒋爱梅等[16]发现,实验组(ADSCs+bFGF+颗粒脂肪组)形成的脂肪组织明显高于对照组(ADSCs+颗粒脂肪组)，可见bFGF在发挥促血管生成作用的同时，还有明显的促细胞分裂和增殖效应，并且能增加未成熟的新生脂肪细胞的数量，使这些细胞增生成熟为大的脂肪细胞。

4 转基因技术的应用

单纯在移植物中加入bFGF也存在诸多问题，如移植术中术后的出血、渗出，会造成因子流失，而且由于外源性bFGF半衰期较短，易失活，扩散快，对热和酸非常敏感，易被蛋白酶分解，故需要大剂量或反复使用，才能维持其生物学效应，并且价格昂贵[17]。如何才能将bFGF更好地应用于脂肪组织工程中是一个急需解决的问题。转基因技术的应用，为解决前述问题提供了可行的方法，展现出了广阔的临床应用前景， Chang等[18]利用VEGF165 转染的BMSCs更好地促进了微血管的再生，加强了移植脂肪早期的血运重建。所以，通过基因转染技术将目的基因导入细胞，可在分子水平改变细胞的结构功能，使目的基因在细胞持续高效表达，而且转基因的细胞合成分泌的内源性生长因子经过适当地翻译修饰过程，可识别更多的配体，能更加有效地和细胞表面受体结合[19]。因此，与外源性生长因子相比，其生物活性更高，降低大剂量或反复使用外源性生长因子的不良反应,更好地优化种子细胞[20]。

目前，一般采用重组腺病毒或慢病毒等[21]作为载体介导bFGF的基因转染。解燕春等[22]利用慢病毒载体介导bFGF基因，成功转染 BMSCs后，其持续分泌bFGF，将其定向移植到大鼠脑梗死灶周围，结果发现，梗死灶周围微血管直径、分支数目及面积，显著高于未转染的对照组。

总之，若将外源性bFGF基因导入脂肪组织工程的种子细胞，可使种子细胞高效持续表达bFGF，进而调控细胞增殖及定向分化，并促进移植体的血管化，能取得良好的预期效果[23]。

5 缓释技术的应用

除了基因转染技术，缓释技术也是解决bFGF在应用时扩散快、易降解、半衰期短等难题的理想方法。Khanna 等[24]利用多层海藻酸钠微球持续释放bFGF，在植入大鼠大网膜的模型中，CD31染色表明，载有600 ng的bFGF微球组刺激新生血管生成的密度，显著高于空微球组，bFGF可产生快速和持续的血管生成反应。靳元嵘和杨瑟飞[25]将bFGF稀释成浓度为2 mg/L的生理盐水溶液后，滴注葡聚糖颗粒，使之膨胀至停止，成为湿沙状，制成bFGF-葡聚糖缓释颗粒；再取大鼠腹股沟脂肪行自体脂肪移植，植入大鼠背部皮下，其中加入0.3 ml bFGF-葡聚糖缓释颗粒的实验组包膜和移植体内的血管计数，明显高于加入0.3 ml生理盐水葡聚糖颗粒对照组。

此外，bFGF具有与肝素结合的能力，肝素可稳定其活性，使其免受热、酸、蛋白水解酶的破坏。为促进血管生成，生物支架可与肝素进行交联，再长时间浸入bFGF溶液中，令肝素充分吸附一定量的bFGF，利用复合生物支架对bFGF的结合和控释能力，促进脂肪组织工程的血管重建[26]。Lu等[27]利用该方法处理脂肪组织去细胞支架，植入小鼠体，利用脂肪组织ECM支架具备的自发成脂诱导环境，刺激小鼠体内自发形成脂肪组织[28]，同时利用肝素对bFGF较强的结合和控释能力，有效地诱导构建的脂肪组织中新生血管形成。

6 结语

组织工程脂肪诱导血管生成不足，会限制干细胞的增殖分化，因此，要实现组织工程脂肪的血管化，必须要有促血管生成因子的存在。bFGF能趋化血管内膜的各类细胞，并促进其增殖和迁移，明显加强新生血管的形成，是理想的血管生成因子。不仅如此，bFGF还可促进干细胞的分裂增殖，促进脂肪干细胞的成脂化。通过多种技术将bFGF应用于脂肪组织工程，利用其多样的生物学特性，可提高干细胞生物学性能，并诱导其定向成脂分化，显著提高工程化脂肪组织的血管化，使组织再生。相信，随着人们对bFGF的不断研究认识，以及组织工程技术的不断发展提高，bFGF会在脂肪组织工程的构建中发挥更加重要的作用。

[1] Moyse E, Segura S, Liard O, et al. Microenvironmental determinants of adult neural stem cell proliferation and lineage commitment in the healthy and injured central nervous system[J]. Current stem cell research & therapy, 2008,3(3):163-184.

[2] Hartung O, Huo H, Daley GQ, et al. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells[J]. Curr Protoc Stem Cell Biol, 2010, Chapter 1:Unit 1C.10.

[3] Xiong N, Yang H, Liu L, et al. bFGF promotes the differentiation and effectiveness of human bone marrow mesenchymal stem cells in a rotenone model for Parkinson′s disease[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2013,36(2):411-422.

[4] Oladipupo SS, Smith C, Santeford A, et al. Endothelial cell FGF signaling is required for injury response but not for vascular homeostasis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014,111(37):13379-13384.

[5] Nie SP, Wang X, Qiao SB, et al. Improved myocardial perfusion and cardiac function by controlled-release basic fibroblast growth factor using fibrin glue in a canine infarct model[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2010,11(12):895-904.

[6] Poole A, Knowland N, Cooper E, et al. Transitory FGF treatment results in the long-lasting suppression of the proliferative response to repeated FGF stimulation[J]. J Cell Biochem, 2014,115(5):874-888.

[7] Yamachika E, Tsujigiwa H, Matsubara M, et al. Basic fibroblast growth factor supports expansion of mouse compact bone-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and regeneration of bone from MSC in vivo[J]. J Mol Histol, 2012,43(2):223-233.

[8] 黄桂玲, 邓 宇. 碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞扩增及分化潜能的影响[J]. 中华实验外科杂志, 2012,29(11):2274-2276.

[9] Song X, Li Y, Chen X, et al. bFGF promotes adipocyte differentiation in human mesenchymal stem cells derived from embryonic stem cells[J]. Genet Mol Biol, 2014,37(1):127-134.

[10] Vishnubalaji R, Al-Nbaheen M, Kadalmani B, et al. Comparative investigation of the differentiation capability of bone-marrow-and adipose-derived mesenchymal stem cells by qualitative and quantitative analys-is[J]. Cell Tissue Res, 2012,347(2):419-427.

[11] Gir P, Oni G, Brown SA, et al. Human adipose stem cells: current clinical applications[J]. Plast Reconstr Surg, 2012,129(6):1277-1290.

[12] 徐扬阳, 姜 南, 杨 柳, 等. 重组人碱性成纤维细胞生长因子对人脂肪干细胞分化为脂肪细胞的影响[J]. 中华医学美学美容杂志, 2013,19(2):134-137.

[13] Monti M, Donnini S, Morbidelli L, et al. PKCε activation promotes FGF-2 exocytosis and induces endothelial cell proliferation and sprouting[J]. J Mol Cell Cardiol, 2013,63(0):107-117.

[14] 孙 哲. 脂肪干细胞与碱性成纤维细胞生长因子在颗粒脂肪移植中应用的研究进展[J]. 医学综述, 2012,18(15):2401-2403.

[15] 靳元嵘, 杨瑟飞. 不同细胞因子对脂肪移植体中前脂细胞和早期血运重建的生物学效应[J]. 中国口腔颌面外科杂志, 2013,11(6):468-471.

[16] 蒋爱梅, 王艳梅, 董毅龙, 等.脂肪干细胞结合碱性成纤维细胞生长因子辅助颗粒脂肪移植的实验研究[J]. 昆明医科大学学报, 2013,34(4):8-12.

[17] Riuzzi F, Sorci G, Beccafico S, et al. S100B engages RAGE or bFGF/FGFR1 in myoblasts depending on its own concentration and myoblast density. Implications for muscle regeneration[J]. PloS one, 2012,7(1):e28700.

[18] Chang L, Wang J, Zheng D, et al. Improvement of the survival of autologous free-fat transplants in rats using vascular endothelial growth factor 165-transfected bone mesenchymal stem cells[J]. Ann Plast Surg, 2014,72(3):355-362.

[19] Goessler UR, Riedel K, Hörmann K, et al. Perspectives of gene therapy in stem cell tissue engineering[J]. Cells Tissues Organs, 2006,183(4):169-179.

[20] 郑 彬, 孙 峰, 赵 戈. 碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠胎肝干细胞培养的优化作用[J]. 中华移植杂志 (电子版), 2013,7(2):22-26.

[21] 李 丹, 乔 群, 王晓军, 等. 腺病毒与慢病毒载体对人脂肪间充质干细胞转导效率及基因表达的差异[J]. 中国美容医学, 2009,18(3):342-345.

[22] 解燕春, 关景霞, 曾艳平, 等. 慢病毒介导bFGF基因修饰的骨髓基质细胞对脑梗死后血管新生的影响[J]. 卒中与神经疾病, 2013,20(5):265-268.

[23] 郑颖娟, 田建昌. 碱性成纤维细胞生长因子基因转染优化脐带间充质干细胞的培养[J]. 中国组织工程研究, 2013,(45):7885-7890.

[24] Khanna O, Huang JJ, Moya ML, et al. FGF-1 delivery from multilayer alginate microbeads stimulates a rapid and persistent increase in vascular density[J]. Microvasc Res, 2013,90:23-29.

[25] 靳元嵘, 杨瑟飞. 碱性成纤维细胞生长因子缓释体系诱导脂肪移植体早期血运重建[J]. 中国组织工程研究, 2013,(44):7745-7750.

[26] Singh S, Wu BM, Dunn JC. The enhancement of VEGF-mediated angiogenesis by polycaprolactone scaffolds with surface cross-linked heparin[J]. Biomaterials, 2011,32(8):2059-2069.

[27] Lu Q, Li M, Zou Y, et al. Delivery of basic fibroblast growth factors from heparinized decellularized adipose tissue stimulates potent de novo adipogenesis[J]. J Control Release, 2014,174:43-50.

[28] Turner AE, Yu C, Bianco J, et al. The performance of decellularized adipose tissue microcarriers as an inductive substrate for human adipose-derived stem cells[J]. Biomaterials, 2012,33(18):4490-4499.

全军医学科研“十二五”重点课题资助项目 (BWS1IC061)

730030 甘肃 兰州,兰州大学第二临床医学院(田亚菲)；兰州军区兰州总医院 全军烧伤整形外科中心(刘 毅)

田亚菲(1988-)，男，甘肃兰州人，硕士研究生.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.017

2014-11-12)