HGF对心肌细胞凋亡保护作用的机制研究

曲环 李美红 陈琛

HGF对心肌细胞凋亡保护作用的机制研究

曲环 李美红 陈琛

目的分析肝细胞生长因子(HGF)对于心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法分离培养乳鼠心肌细胞, 将培养的乳鼠心肌细胞饥饿处理8 h后, 采用流式细胞仪观察HGF减少过氧化氢(H2O2)引起的心肌细胞凋亡的保护作用, 计算凋亡细胞百分率；采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白FOXO3a变化；并观察使用lipofectamin2000 转染技术敲除FOXO3a基因后, HGF对H2O2引起心肌细胞凋亡保护作用的变化。结果与对照组相比, 研究组HGF可以显著减少, H2O2处理引起的心肌细胞凋亡, 检测显示心肌细胞内FOXO3a含量基本无变化, 磷酸化的FOXO3a的含量随时间变化有所增加。而在敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌细胞凋亡的能力显著减低。结论HGF抑制心肌细胞凋亡损伤,使心肌细胞中的FOXO3a磷酸化增加, 提示HGF促进FOXO3a的磷酸化可能与其对心肌细胞凋亡的保护作用相关。

肝细胞生长因子；心肌细胞凋亡；保护作用

肝细胞生长因子(HGF)具有促血管形成作用, 减少心肌细胞凋亡作用。实验证明HGF可抑制心肌肥大中心肌细胞的凋亡, 通过抗心肌间质纤维化作用和抑制心肌细胞凋亡作用而抑制左室重构［1］。HGF的作用机制可能是通过MAPK中ERK1/ERK2通路、P38信号转导通路、PI3K/AKT等调节细胞增殖和凋亡过程。本试验通过研究HGF对心肌细胞凋亡的保护作用机制, 阐明HGF具体细胞信号作用途径, 心血管疾病的防治提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 新生乳鼠(北京大学深圳医院动物中心)；胎牛血清；DMEM培养基；HGF；H2O2；凋亡试剂盒；5-溴脱氧尿嘧啶；一抗；二抗；α-sarcomeric actin。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞分离培养 分步消化、差速贴壁、化学抑制法分离纯化新生SD大鼠心肌细胞后代作原代培养；已培养48 h的心肌细胞饥饿处理8 h后, 分为两组：对照组加入终浓度为0.5 mmol/L的H2O2培养4 h, 研究组加入终浓度为0.5 mmol/L的H2O2和40 ng/ml HGF培养4 h。

1.2.2 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率 根据AnnexinVFITC凋亡检测试剂盒使用说明, 贴壁的心肌细胞经胰酶消化后, PBS洗涤2次, 收集1×105个细胞, 加入5000 μl L1xBinding buffer重悬细胞, 再加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl Propidium Iodide(PI)充分混匀, 室温避光孵育15min, 流式细胞仪分别检测对照组和试验组心肌细胞凋亡率, 每组各检测5个样本。

1.2.3 Western-bolt法观察细胞信号转导相关蛋白表达 获得的各组细胞分别提取总蛋白, 取适量(约20 μg)蛋白,98℃变性5 min,12％SDS-PAGE分离, 电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。含5％脱脂奶粉缓冲生理盐水(TBS/T)封闭1 h, 加入一抗(1：1000),4℃过夜, TBS/T洗3次, 加入二抗(1：2000)孵育1 h, TBS/T洗3次, 加入HRP 化学发光底物,压胶片曝光。

1.2.4 使用lipofectamin2000 转染 转染前1 d, 将0.5×105～2×105个细胞接种于培养板中, 每孔中加入约1 ml无抗生素的培养基, 使转染时的细胞密度能够达到30％～50％； 取5 μl/孔 Lipofectamine2000,100 μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释。轻轻混和后在室温孵育5 min； 取5 μl FAM-siRNA, 稀释, 轻轻混和均匀;稀释的经过5 min 的孵育后,与稀释FAM-siRNA轻轻混和, 室温静置20 min, 形成FAM-siRNA-转染试剂混和物。将FAM-siRNA-转染试剂混和液,加入含有细胞及培养液(约含1 ml)的孔中, 轻轻摇晃孔板,使混和；转染6 h后即可检测转染效率：流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 实施t检验；计数资料以率(％)表示, 实施 χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

与对照组相比, 研究组HGF可以显著减少(P＜0.05), H2O2处理引起的心肌细胞凋亡, 检测显示心肌细胞内FOXO3a含量基本无变化, 磷酸化的FOXO3a的含量随时间变化有所增加, 提示HGF的保护作用可能与FOXO3a的磷酸化增加有关。敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌细胞凋亡的能力与显著减低, 进一步表明HGF抑制心肌细胞凋亡的作用机制可能主要通过PI3K/Akt/FOXO3a途径, 磷酸化心肌细胞中FOXO3a, 使其活性减低, 从而抑制心肌细胞凋亡发生,而起到对心肌细胞的保护作用。

3 讨论

FOX各家族功能多种多样, 包括各种转录因子、参与细胞增殖、转化及分化过程。作为FOX家族的亚组, FOXO在新陈代谢、细胞增殖、细胞存活及对氧化应激的反应等生物进程中起重要作用。哺乳动物FOXO蛋白质家族有4个成员：FOXO1、FOXO3A 、FOXO4和FOXO6。其中FOXO3A在细胞、组织与胚胎的发育、体内葡萄糖内稳态、卵泡的成熟、细胞增殖、细胞凋亡、对DNA的损伤反应等过程中发挥重要作用。心脏组织以FOXO3A分布为主, 在心肌细胞凋亡中发挥重要作用［2］。活化FOX03A能抑制血管平滑肌增殖, 抑制心肌细胞增生肥大及抗氧化应激等。非磷酸化状态的FOXO3A为活性转录因子, 主要存在心肌细胞核中, FOXO3A磷酸化后与细胞核内的结构蛋白结合, 由细胞核内转移到核外, FOXO3A丧失转录活性, 其抗细胞增殖, 抗心肌肥厚等作用均被抑制［3］。研究发现HGF抑制心肌细胞凋亡损伤, 使心肌细胞中的FOXO3A磷酸化增加, 提示HGF促进FOXO3A的磷酸化可能与其对心肌细胞凋亡的保护作用相关。

［1］刘峰. 高血压的心脏并发症. 中国实用内科杂志,2002,22(4):11.

［2］姜勇, 罗深秋. 细胞信号转导的分子基础与功能调控. 北京：科学出版社,2005:74.

［3］曹冬梅, 卢建. 叉头框(Fox)转录因子家族的结构与功能 . 生命科学,2006,8(10):16.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.05.197

2014-12-01］

518036 北京大学深圳医院心内科(曲环 李美红),体检科(陈琛)