应用快速孵育法优化酶联免疫吸附实验过程探讨——以乙型肝炎病毒表面抗原检测为例

刘 丽，何 露，孔凡虹，曹敬丽，贾子琪，刘文松，许 震，王雅杰，3

（1.首都医科大学附属北京天坛医院临床医学研究实验室，北京100050；2.首都医科大学附属北京天坛医院，北京100050；3.首都医科大学附属北京天坛医院检验科，北京100050）

应用快速孵育法优化酶联免疫吸附实验过程探讨——以乙型肝炎病毒表面抗原检测为例

刘 丽1，何 露2，孔凡虹2，曹敬丽1，贾子琪2，刘文松2，许 震2，王雅杰1，3

（1.首都医科大学附属北京天坛医院临床医学研究实验室，北京100050；2.首都医科大学附属北京天坛医院，北京100050；3.首都医科大学附属北京天坛医院检验科，北京100050）

目的 利用快速孵育法优化酶联免疫吸附实验操作流程，通过缩短孵育时间，以提高工作效率。方法 收集化学发光法定量检测乙肝表面抗原阳性高值样本30例、阳性中值样本30例、阳性临界值样本30例、阴性样本30例，使用ELISA试剂盒说明书推荐方法和快速孵育法同时进行检测，比较检测结果相关性。结果 使用酶标板孵育器将孵育时间缩短至原来的1/2、1/3时，ELISA试剂盒说明书推荐方法、快速孵育法与化学发光法检测结果符合率100%；当孵育时间缩短至原来时间的1/4时，两种方法与化学发光法阴性、高值和中值样本检测结果符合率100%；临界值样本检测时，ELISA试剂盒说明书推荐方法与化学发光法检测结果符合率100%，快速孵育法与化学发光法结果6例不一致，检测结果符合率80%。结论 通过实验证实，酶联免疫吸附实验时，快速孵育法可满足临床检测，可将孵育时间缩短至原试剂盒推荐时间的1/3或1/2，可提高工作效率。

酶联免疫吸附实验； 快速孵育法

酶联免疫吸附实验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）是临床实验室中最常使用的方法之一，是一种以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种实验技术。ELISA技术操作简易、成本低、数据可靠，在临床和科研中均有比较广泛的应用［1］。本文利用ELISA技术进行乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）检测，其主要实验步骤为加样、抗原抗体孵育、洗涤、生物酶素孵育、洗涤、辣根过氧化酶二抗孵育、显色、终止、酶标仪读取结果。孵育是ELISA检测中影响检测成败的最关键因素之一［2］，本文中ELISA实验过程涉及三次孵育，是耗时最长的实验步骤。酶标板快速孵育器采用前期加温造就一个孵育室高温环境，使酶标板与孵育室的温差增大而快速升温，以缩短孵育时间。本文通过利用快速孵育器孵育与ELISA试剂盒推荐方法、化学发光法进行临床上常见指标乙型肝炎病毒（简称乙肝）表面抗原的检测，探讨利用快速孵育法优化酶联免疫吸附实验操作流程的可能性。

材料与方法

1 样本来源

收集乙肝患者定量检测乙肝表面抗原的血清样本，其中大于试剂盒检测上限（≥250 IU/mL）的高值样本30例，男性14例，女性16例，年龄26～58岁，37.2±11.0岁；中值样本（100～250 IU/mL）30例，其中24例男性，6例女性，年龄29～70岁，45.4± 2.0岁，实际检测结果100.69～209.98IU/mL；低值样本（0～100 IU/mL）30例，其中23例男性，7例女性，年龄26～69岁，48.0±12.4岁，实际检测结果1.25～82.38 IU/mL；收集正常体检样本，乙肝表面抗原阴性样本30例，其中11例男性，19例女性，年龄25～79岁，49.0±14.4岁。所有样本 3000r/min离心10min，分装于离心管中，存储在-80℃冰箱中，用于ELISA说明书推荐方法、快速孵育法检测，检测时所有样本随机顺序加样。

2 仪器与试剂

2.1仪器 美国雅培Architect i2000化学发光免疫分析仪，美国MD酶标仪，成都盖森酶标板快速孵育器，白洋离心机，美国RAININ移液器。

2.2试剂 化学发光法乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒（美国雅培ARCHITECT公司），酶联免疫法乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（北京万泰生物药业有限公司）。

3 实验方法

3.1化学发光法定量检测HBsAg的方法（E法） 按照美国雅培ARCHITECT公司乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂说明书操作，检测前质控结果在控。

3.2ELISA方法批内重复性实验（精密度）

选用高、低两个质控品，使用ELISA方法进行重复性检测，每个质控品连续重复测定20次，记录S/CO值，计算变异系数（CV，%）。ELISA检测时，试剂盒室温平衡30min后进行A、B、C、D四种实验方法检测，其中A法按说明书使用常规方法进行孵育，B、C、D法均使用酶标板快速孵育器进行孵育，其中B法孵育时间选用原来1/2时间，C法孵育时间选用原来1/3时间，D法孵育时间选用原来1/4时间，具体孵育时间见表1，其他操作步骤严格遵守说明书进行。

表1　不同方法ELISA实验孵育时间

3.3ELISA方法检测 使用临床收集样本进行ELISA检测，样本随机顺序加样，ELISA检测方法同3.2。记录样本S/CO的值（S/CO＜1为阴性，S/CO≥1为阳性）。

4 结果统计

A法与化学发光法（E法）进行比较，B、C、D法再分别和A法进行比较，分别计算临界值样本、阴性值样本、阳性值样本符合率。所有结果均使用S/CO值进行计算，使用SPSS统计软件对实验结果进行χ2检验。

结果

实验设置阴性、阳性对照，根据说明书标准，阴性质控结果吸光度值＜0.10、阳性质控结果吸光度值＞0.80时实验结果有效。实验中阴性质控结果吸光度均值0.007，阳性质控结果吸光度均值3.93，实验结果有效。

A法与E法检测结果比较见表2。结果显示，ELISA试剂盒推荐方法检测结果与化学发光法结果完全一致，与化学发光法比较方法无差异（P＞0.05）。

表2　A法与E法检测HBsAg阴阳性情况

A、B、C、D法批内重复性实验（精密度）判断标准为说明书要求的精密度变异系数（CV，%）≤15%。精密度结果使用S/CO值进行计算。实验结果显示，精密度均在15%以内。见表3。

表3　A、B、C、D法检测HBsAg精密度结果

实验结果显示（表4至表6），用酶标板快速孵育器进行实验，使用北京万泰生物药业HBsAg诊断试剂盒，当时间缩短为原来的1/2、1/3时，阴性阳性结果与A法完全一致（P＞0.05），敏感性100%，特异性100%，符合率100%；当时间缩短为原来的1/4时，阴性结果完全一致，阳性结果有6例不符，且均在临界值样本，敏感性 93.3%，特异性 100%，样本符合率80%，与A法有差异（P＜0.05）。

表4　A、B、C、D法检测HBsAg阴阳性情况

表5　B、C、D法检测HBsAg敏感性特异性情况

表6　B、C、D法检测HBsAg阴阳性符合率情况

讨论

ELISA检测方法是临床检验最为常用的实验方法之一，其操作简便、成本低、特异性好、灵敏度高［3-4］，无需特殊仪器，易于推广和标准化。但是其操作时间长，孵育时间约占到实验总时间的一半，每天可检测的数量有限。如果可以缩短实验流程将会提高工作效率。

本文乙肝表面抗原ELISA检测方法的原理为双抗体夹心法［5］，即先将抗体结合到某种固相载体表面，然后加入待测抗原样本，再加入酶标抗体，形成双抗体夹心结构，最后加入底物进行显色，由于酶的催化效率很高，故可放大反应效应，从而使测定方法达到很高的敏感度。整个实验过程中，每一步抗原抗体的反应均需要相应的孵育，孵育时间合适才能使抗原抗体有效的结合，最终得到可信的结果。

常规ELISA实验的孵育［6］都是在水浴锅或者温箱里进行的，升温曲线较慢，50～60min样本温度才能趋于37℃恒温点，而且温箱或水浴锅存在受热不均匀、温度不准确或ELISA反应板周围环境可达到预期温度而孔内温度不能达到等问题。

酶标板快速孵育器主要通过发热模块产生空气循环加热，同时使用多个方向风扇旋转使孵育腔内形成流动气体，保证温度的均匀性。其核心快速功能是采用特有的微处理温控技术，加快孵育样本升温曲线，使样本温度快速稳定达到最佳孵育恒温点（常规水浴等方式的升温曲线较慢，50～60min样本温度才能趋近于37℃恒温点，而快速孵育方式可控制在10min以内趋近恒温点）；同时孵育全过程中结合振荡，促进抗原抗体结合，能一定程度上增加试剂的灵敏度。从图1中的曲线4可以看出，酶标板在恒温箱中，微孔液体从常温状态要升到最佳孵育的恒温线（一般为37℃）处，需要较长的升温过程。实验证明，要达到接近恒温线的E点，需要50min以上，而从E到F点最佳孵育段，仅需要5min即可。由此可见，整个孵育过程，绝大部分时间浪费在较长的升温过程上。而酶标板快速孵育器是在短时间内将孵育室温度升到高于恒温点4℃以上，拉大孵育室腔体空气与酶标板微孔液体的温差，当曲线（2）酶标板温度离恒温点还差1～2℃时，此时曲线1孵育室腔体温度也升到最高点B（此点根据室温实际情况自动设置，一般高于恒温点4～10℃以内），然后断开加热，鼓风机继续排风快速降温。降温过程温差仍然很大，酶标板继续升温，当到达接近恒温点的C点时，孵育室温度也迅速降到恒温点恒温，以保证微孔液体在不超过37℃的同时与孵育室在恒温点趋于一致的情况下进行孵育。

本实验使用酶标板快速孵育器进行孵育，在达到相等孵育效果的前提下，可大大节省孵育时间。根据抗原抗体反应原理，在一定的温度范围内，反应的温度升高，分子运动加快，可以使反应的时间缩短［7］，酶标板快速孵育器就是采用前期加温造就一个孵育室高温环境，使酶标板与孵育室的温差增大而快速升温。当酶标板的温度接近最佳孵育的恒温点时，此时孵育室的温度也迅速降到恒温点恒温，大大缩短酶标板的升温时间，从而达到快速孵育的目的。

根据ISO15189医学实验室-质量和能力的专用要求，乙肝表面抗原为定性检测，实验室使用新方法时需要进行验证。本文对批内重复性（精密度）、临界值、阴性值、阳性值的符合率进行了验证，ELISA试剂盒推荐方法和酶标板快速孵育法的重复性均符合标准。以HBsAg检测为例进行应用快速孵育法优化酶联免疫吸附实验的结果显示，在孵育时间缩短到原来的1/2、1/3时，阴性、阳性低值、阳性中值、阳性高值样本符合率达到100%；在孵育时间缩短到原来的1/4时，阳性低值即临界值样本符合率80.0%，小于95%，故该孵育时间不可采用。临床上临界值样本结果的判读十分重要，误读会导致结果不准确，影响医生对病情的治疗，故建议使用酶标板快速孵育器进行实验时，时间最短缩短为原来的1/3。

通过实验证实，酶联免疫吸附实验时，快速孵育法可满足临床检测，可以通过缩短孵育时间提高整个实验时间，提高工作效率。酶标板快速孵育法可用于ELISA实验孵育，但具体孵育时间需在自己实验室对具体实验项目进行摸索、验证。

［1］Wongkamchai S，Satimai W，Loymek S，et al.An ELISA kit with two detectionmodesforthediagnosisoflymphaticfilariasis.J Helminthol，2015，89（5）：552-558.

［2］李晓霞，迟伟群，姚玉虹，等.温湿度对高通量ELISA检测系统检测梅毒螺旋体抗体影响的分析.标记免疫分析与临床，2015，22（1）：46-51

［3］Weng Z，Zhao Q.Utilizing ELISA to monitor protein-protein interaction.Methods Mol Biol，2015，1278：341-352.

［4］Williams S，Schulz P，Sierks M R.A sensitive phage-based capture ELISA for sub-femtomolar detection of protein variants directly from biological samples.Biotechnol Prog，2015，31（1）：289-298.

［5］王兰兰，许化溪.临床免疫学检验.第5版.北京：人民卫生出版社，2012：83.

［6］Garber E A，Thole J.Application of microwave irradiation and heat to improve gliadin detection and ricin ELISA throughput with food samples.Toxins（Basel），2015，7（6）：2135-2144.

［7］马小燕，张弘.ELISA不同孵育条件HBsAg检测结果的比较.广西医科大学学报，2010，27（3）：440-441.

（张增武编辑）

Evaluation of Rapid Incubation Optimization Process of Enzyme-linked Immunosorbent Assay on Hepatitis B Surface Antigen Detection

LIU Li，HE Lu，KONG Fan-hong，CAO Jing-li，WANG Ya-jie
（Beijing Tian Tan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

Objective To evaluate the rapid incubation of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）on hepatitis B surface antigen.The goal is to reduce the incubation time in order to improve operational efficiency.Methods Hepatitis B surface antigen positive samples detected by chemiluminescence were used in the study.The samples were divided into 3 groups with 30 cases in each group based on the posititivity value，highly positive，borderline positive，negative samples.All samples were tested with ELISA kit both by standard method recommended by manufacturer and by fast incubation method.The results were comparated and analyzed.Results When incubation time was shortened to one-half and one-third of standard time，the results from rapid incubation method and chemiluminescence detection matched 100%.When the time is shortened to one quarter of standard time the results from rapid incubation method and chemiluminescence detection matched 100%in all highly positive samples.For the borderline samples，results from both methods matched 100%.For fast incubation method，there were 6 results which were inconsistent with chemiluminescence，80%.Conclusion The study confirmed that ELISA rapid incubation method satisfied the use of clinical testing；the incubation time may be reduced to one-third or one-half of recommended time.The rapid incubation method will improve the work efficiency in clinical laboratories.

ELISA； Rapid Incubation

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.028

2015-12-24；

2016-01-07

家自然科学基金（81572474）；首都医科大学校长基金（2015JYY80）；北京市中医药科技发展资金项目（JJ2015-14）

王雅杰。E-mail：tiantanwyj@aliyun.com