血管内皮生长因子与股骨头坏死修复关系的研究进展*

罗 程张元斌应 俊徐涛涛王萍儿金红婷童培建1，2，△肖鲁伟1，2，

（1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学第一附属医院，浙江 杭州 310006；3.浙江省骨伤研究所，浙江 杭州 310053）

·综 述·

血管内皮生长因子与股骨头坏死修复关系的研究进展*

罗 程1，3张元斌1，3应 俊1，3徐涛涛1，3王萍儿3金红婷3童培建1，2，3△肖鲁伟1，2，3

（1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学第一附属医院，浙江 杭州 310006；3.浙江省骨伤研究所，浙江 杭州 310053）

股骨头坏死 血管内皮生长因子 信号通路 综述

血管内皮生长因子 （VEGF），又称血管渗透因子（VPF），是一个以二硫键或非共价键联接的同源二聚体糖蛋白，是机体最主要的血管生成因子。根据编码VEGF mRNA的剪接方式不同，VEGF蛋白含氨基酸数目具有 5种形式：VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206和VEGF145，以VEGF165较为常见［1］。股骨头坏死（ONFH）是一种由多种原因引起股骨头内活性细胞成分死亡，导致股骨头结构改变，继而引起股骨头塌陷及髋关节功能障碍的疾病。缺血缺氧是股骨头坏死发生发展的关键环节［2］，股骨头局部组织因缺血缺氧而发生坏死，股骨头正常结构被破坏，而与此同时股骨头的自身修复反应也随之发生［3］，局部缺血缺氧可启动VEGF相关信号通路，上调VEGF表达，VEGF与其受体等结合，激活下游通路，从而促进成血管性细胞的迁移、增殖、分化、存活以及血管通透性增加等一系列细胞水平的活动［4-6］，促进新血管的生成进而促进坏死组织的修复。因此，VEGF及其相关信号通路在ONFH形成及修复过程中发挥至关重要的作用。现就近年来VEGF与股骨头坏死修复关系的研究进展综述如下。

1 VEGF与ONFH缺血缺氧机制

股骨头在缺血、缺氧环境下，机体通过稳定HIF-1α表达，上调VEGF表达水平，随后与其受体结合，启动VEGF信号通路调控坏死区域的血管重建和骨修复活动［7］。在VEGF基因转录起始点上游大约1 kb的5′侧翼区域有286 bp的低氧反应元件（HRE），HRE区域内存在HBS 5′ATCGTGGG 3′和HIF-1结合的辅助序列（HAS）5′CACAG 3′［8］。在组织含氧量正常的情况下，通常在细胞质内的HIF-1α受氧敏感的脯氨酰羟化酶（PHDs）修饰、降解、固定，基本维持在阈值以下的低水平［9］。然而，当细胞缺氧时，对氧敏感PHDs的活性被抑制，使得HIF-1α表达显著增加，HIF-1α从胞质转移到细胞核，并与核内持续表达的结构亚基HIF-1β结合，形成异二聚体HIF-1，使HIF-1与VEGF5′端增强子结合，从而增加VEGF转录，上调VEGF表达，并激活其受体，启动VEGF信号通路，从而调控成血管性细胞增殖、迁移、存活、凋亡和通透性，促进新生血管形成以及调节成骨性细胞的分化增殖等促进坏死骨的修复［10］。

2 VEGF在ONFH修复中的成血管作用

VEGF水平上调后与其受体结合，启动VEGF下游通路，调控ONFH区血管新生［11］。VEGF受体（VEGFR）家族有3种亚型：VEGFR-1（F1t-1）、VEGFR-2（KDR/ Flk-1）和VEGFR-3（Flt-4），在成骨细胞和血管内皮细胞中主要存在着VEGFR-1和VEGFR-2［12］，在破骨细胞和骨髓基质干细胞中则主要存在VEGFR-2，而造血干细胞中主要存在VEGFR-1；股骨头坏死的血管重建活动中主要是通过与VEGFR-2结合介导［11］。骨组织细胞（如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞等）也参与血管重建，但血管重建活动主要是通过内皮细胞增殖、迁移和血管通透性增加，最终促成新血管生成［13］。

2.1 VEGF与细胞迁移 内皮细胞迁移，对于坏死区域血管新生至关重要。VEGF通过蛋白酶水解基底膜来促进内皮细胞迁移，并顺着VEGF和其他生长因子的浓度梯度迁移到坏死组织区域，启动股骨头坏死区域血管重建。其主要途径有：1）VEGFR-2上Tyr1214的磷酸化参与VEGF引起肌动蛋白的重塑［14-15］，VEGF经Cdc42-SAPK2/p38-MAPK活化蛋白激酶-2（MAPKAP K2）信号通路引起内皮细胞张力纤维中激动蛋白重塑［16］；2）衔接蛋白Shb可与VEGFR-2上Tyr1175位点结合并调控VEGF通路引起细胞迁移［17］；3）VEGFR-2上另一个磷酸化重要位点Tyr951可以与T细胞特异性衔接分子 （TSAd）相结合，激活的TSAd和VEGFR2下游的Src形成复合物，调节细胞迁移［18］；4）虽然VEGFR-2结构不含有Y-X-X-M序列，但仍然可以激活PI3K调节细胞迁移［11］；5）衔接蛋白Gab1可以介导VEGFR-2活化PI3K和细胞迁移［19］。此外，磷酸化的VEGFR-2与IQGAP1共结合也可以介导细胞迁移［20］。

2.2 VEGF与细胞增殖 VEGF促进内皮细胞增殖主要是通过细胞膜上VEGFR-2将细胞外信号传递到胞内，激活一系列下游信号通路进行。主要是PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK信号通路，把信号传递到细胞核内启动DNA合成［21］。Tyr1173是受体Flk-1调控血管新生的重要结构，VEGF通路上的PLC-γ、Shb和Sck都可结合到Tyr 1173位点［11］。但对通路上Shb和Sck的作用及机制目前尚不明确，有待进一步研究。

2.3 VEGF与细胞活性 VEGFR-2介导的VEGF信号通路位点PI3K，能调控人脐静脉内皮细胞的存活，而活化的PI3K可以催化PIP2生成PIP3，激活磷酸化蛋白激酶（PKB/Akt）［22］，Akt能够使Bcl-2相关凋亡启动子（BAD）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase 9）磷酸化，而BAD和caspase 9是细胞凋亡调控蛋白。整合蛋白αvβ3对新生血管存活至关重要。VEGFR-2和αvβ3整合蛋白结合可以增加VEGFR-2和Akt的活性［23］。此外，最近研究发现磷酸化的VEGFR-2协同结合位点IQGAP1，通过抑制其内在的GTPase活动来激活IQGAP1［20］，与Rac1结合调节内皮细胞的活性。VEGF信号可以活化内皮型一氧化氮合酶（eNOS）生成一氧化氮（NO），引起血管通透性改变。血管通透性的增加能促进血浆蛋白在细胞基质中沉积，为血管内皮细胞的生长提供临时基质［6］，同时也利于大分子渗出从而促进细胞迁移。

此外，研究表明破骨细胞能促进内皮细胞成血管作用，其效应受VEGF调控［24］。Engsig等通过对移植体外大鼠跖骨的研究，发现血管重建与破骨细胞再生同时发生［25］。骨细胞也通过VEGF-MAPK依赖性通路参与血管重建，Prasadam等发现在骨细胞MLOY4 CM中，阻断VEGF通路，成血管性表型和基因表达会通过ERK通路减少，骨细胞分泌的VEGF能够调节多种成血管性蛋白的合成和成血管细胞的受体系统［13］。也有研究证实作为VEGF的同族体胎盘生长因子（PlGF）只特异性地与VEGFR-1结合，随之启动VEGF信号通路，参与坏死区域的修复［26］。FGF-2也可能通过VEGF受体间接地参与血管重建［27］。

3 VEGF在ONFH修复中的成骨作用

VEGF不仅对股骨头血管再生具有重要的调控作用，还可以调节成骨性细胞在股骨头坏死区域的迁移、分化、增殖，促进股骨头坏死组织的修复［28］。坏死骨的重吸收和随后的新骨的形成是骨重建中两个重要部分，其中破骨细胞是坏死骨组织重吸收的关键细胞，而成骨细胞则主要参与骨的矿化和骨基质沉淀，最后填充被破骨细胞吸收的陷窝。

3.1 VEGF与成骨细胞 VEGF能通过影响成骨细胞直接或间接调节坏死骨的修复。其途径有以下几种：1）VEGF通过内皮细胞调控骨重建过程，骨形成前体细胞沿着血管迁移到前体细胞向成骨细胞分化的损伤区域；2）VEGF通过血管分泌相关机制，刺激内皮细胞分泌成骨性因子，促进骨祖细胞向成骨细胞分化［29］；3）VEGF还可以直接作用于成骨细胞。成骨细胞可分泌VEGF及VEGFR，这可以调节成骨细胞的趋化、分化和扩散［30］。有研究表明VEGF抑制剂导致体外培养的成骨细胞分化减慢；选择性敲除小鼠骨祖细胞的VEGFR-1、VEGFR-2，导致小鼠的骨小梁明显减少；同时小鼠的成骨细胞的分化明显减少，这可能与VEGF调控的RUNX2介导反应减少有关［12］。

研究表明，成骨相关因子（如BMP、PDGF等）和成血管相关因子（如VEGF）在坏死修复过程具有协同作用，其共同组成的微环境在修复过程中必不可少［31］。转录因子Osterix（OSX）作为BMP-2诱导成骨细胞转录的特异性因子，在骨重建中必不可少，其能通过脯氨酸富有蛋白（PRR）激活VEGF信号通路调控VEGF在成骨细胞中的表达［32］。TNF-A，TGF-A和PDGF亦可通过VEGF结构上的-50~-96 bp G+C-丰富区诱导生成VEGF［33］。PDGF还能避免因VEGF使得内皮细胞分化、增殖和聚集形成相对过量导致的血管畸形的发生［34］。3.2 VEGF与破骨细胞 破骨细胞分化、激活、存活的调控主要是通过集落刺激因子-1/巨噬集落刺激因子（M-CSF）和核转录因子配体（RANK ligand）完成［35］。通过对M-CSF缺失的骨硬化症小鼠的研究发现其破骨细胞、骨细胞的明显减少［36］，然而，在骨硬化症小鼠破骨细胞形成过程中，VEGF能替代M-CSF促进其形成；这与VEGF能增强破骨细胞的再生能力和重吸收有关［37］，可能是由于VEGF是破骨细胞再生的重要刺激因子［38］。此外，VEGF还可通过VEGF/VEGFR-2通路增强破骨细胞的骨重吸收和存活能力［24］。Liu等［12］通过VEGFR-1缺失小鼠与正常小鼠的对照研究发现VEGFR-1缺失组小鼠骨髓细胞和破骨细胞的形成显著增加。另外，VEGF还能通过刺激转录因子RUNX2和抑制转录因子PPARc2，调控骨髓干细胞（MSCs）的分化［38］。

4 中医药对VEGF调节作用

大量的研究表明，中医药可通过多种途径调节VEGF表达，促进骨血管新生和股骨头坏死的修复。高冬等［39］研究发现血府逐瘀汤通过VEGF/VEGFR通路促血管新生，诱导内皮细胞增殖、迁移和血管形成，促进坏死区域修复。李引刚等［40］发现复元活血汤可以上调动物模型骨折早期断端局部VEGF、BMP-2表达水平，增加骨折断端局部骨痂厚度。高云等［41］发现海螵蛸能够提高骨折早期VEGF mRNA的表达，并且能够在达到峰值后VEGF mRNA的表达量于中后期维持于相对较高水平，促进骨折早期骨痂新生微血管增生，加速骨折后期骨痂内微血管完善，从而促进骨折愈合。桃红四物汤能够有效提高VEGF表达，增强微血管增生，而其中木香与红花进行配伍能够较为显著地提高VEGF表达水平［42］。

5 小结与展望

VEGF对股骨头坏死区新血管生成和坏死骨组织修复具有至关重要的作用。在股骨头坏死发生发展过程中，缺氧缺血可以上调HIF-1α，诱导上调VEGF的表达，随后通过与VEGFR-1、VEGFR-2等结合调控成血管性细胞增殖、迁移、存活、凋亡和血管通透性的增加，进而促进坏死区域血管新生；同时，VEGF还调节骨重建中成骨、破骨细胞的功能，促进坏死区域的重吸收和新骨的形成。VEGF促进骨损伤的修复相关研究也取得不少的成果，这对临床上利用VEGF组织工程材料治疗早期股骨头坏死提供了基础，对股骨头坏死治疗方法进一步完善也具有指导意义。但VEGF在ONFH修复中促成骨作用是怎样通过VEGF信号通路实现的，除此之外还有哪些相关通路也参与其中等都有待进一步深入研究；再有，在股骨头坏死修复的微环境中，成骨相关因子（如MMP、BMP、PDGF、IGF等）与VEGF成血管/成骨协同作用机制，也有待进一步研究。此外，在股骨头坏死修复中成骨、成血管两个关键部分又是通过什么机制紧密联系并相辅相成，目前其机制尚不明确，值得进一步研究。

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1004-745X（2015）04-0653-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.04.031

2015-01-28）

国家自然科学基金资助项目（81273770）；国家自然科学基金资助项目 （81373669）；浙江省科技厅重大专项（2012C13017-2）；浙江省中西医结合骨关节病研究科技创新团队（2011R50022）；浙江省骨关节疾病中医药干预技术研究重点实验室（2013E10024）

△通信作者（电子邮箱：luocheng981985300@163.com）