宫颈癌的免疫学发病机制和疫苗的研究进展①

黄海霞 李桂玲

(复旦大学附属妇产科医院，上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海 200090)

在发展中国家，每年宫颈癌新增病例约10 万，死亡人数约3 万，不管是发病率还是死亡率在妇科恶性肿瘤中均占据首位，且发病年龄逐渐年轻化，严重威胁女性的生命与健康［1］。因此，早发现、早诊断、早治疗、早预防，对于宫颈癌患者来说非常必要。20 世纪以来，借助于细胞分子生物学和免疫学的飞速发展，宫颈癌在免疫学上的研究成为了热点。大量统计分析或研究结果表明，宫颈癌的发生与发展和机体的免疫功能，尤其是宫颈局部的免疫功能密切相关。本文跟踪国内外宫颈癌免疫学相关的研究，在了解宫颈癌发病因素和发病机制的基础上进一步探讨其免疫治疗与预防的最新成果，如第二代预防性疫苗的研究和治疗性疫苗的三期临床试验进展等。

1 发病因素

1.1 主要病因-HPV 自20 世纪50 年代，人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)被推测能诱发宫颈癌之后，大量流行病学和分子生物学研究证实了高危型HPV 感染是发生宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宫颈癌的必要病因。HPV 是一种双链闭环的小型DNA 病毒，基因片段分为3 个区:上游非编码区，早期编码区，晚期编码区。早期编码区包括E1～E7，编码产物主要调节病毒DNA 复制(E1，E2)、病毒RNA 转录(E2)、细胞骨架重组(E4)和细胞转化(E5，E6，E7);E6、E7 作为CIN 和宫颈癌发病的高危因素，E6 可诱发P53 降解，E7 可抑制Rb 的抑癌功能，所以是目前研究HPV 致癌机制及针对HPV 相关癌症的防治疫苗研制中的重要靶基因。晚期编码区包括L1 和L2，编码产物是病毒衣壳的结构元件，其中L1 为主要衣壳蛋白，L2 为次要衣壳蛋白。如果HPV 感染人体后，机体能够针对HPV 衣壳蛋白L1 和L2 产生中和抗体，就能够预防HPV 的感染。

目前已经得到鉴定的HPV DNA 有百余种，其中低危型(HPV6、11、30 等)可引起尖锐湿疣、扁平湿疣等良性病变，高危型(HPV16、18、31、58 等)主要导致CIN 和宫颈癌。流行病学显示，约99%CIN和宫颈癌是由高危型HPV 持续感染所致，其中2/3患者与HPV16、18 的持续感染相关，HPV16 型多发展为宫颈鳞癌，而HPV18 型与宫颈腺癌密切相关。E6 蛋白可能在其恶性转化中扮演重要角色，主要通过抑制P53 与DNA 结合，导致P53 蛋白降解失活;水解Bax、Bcl-2，从而抑制凋亡;激活端粒酶，使正常细胞永生化;使感染的HPV 细胞逃逸机体免疫［2］。因此，HPV16 和HPV18 E6 蛋白可作为HPV 持续感染及CIN 发生与发展的重要预警指标，提示我们在开展HPV DNA 临床检测时，必要者作HPV16 和HPV18 E6 蛋白检测，为宫颈癌的早期诊断和预防提供最新参考价值。E2 蛋白作为主要的调节蛋白，对E6 蛋白和E7 蛋白起抑制作用。大多数宫颈癌患者的HPV 基因整合进宿主染色体DNA 并导致病毒E2 基因的破坏，从而导致E6 和E7 基因的上调。

国外一项研究筛选了103 名健康人群，检测其体内不同部位HPV 混合感染的情况，发现HPV 总患病率为68.9%，感染率(皮肤61.3%，阴道41.5%，口咽30%，肠道17.3%)，48.1%HPV 感染者存在多种HPV 亚型混合感染的现象［3］。免疫因素可能是HPV 混合感染长期发生的风险因素，而短期风险主要是多个性伴侣或活跃的性活动［4］。由于非致癌病毒可以通过干扰病毒或免疫交叉反应来刺激/抑制共存的致癌病毒，从而促进癌变，所以混合感染也是导致宫颈癌变的一个高危因素。但是，目前常用的检测工具只能检出导致宫颈癌发生的少数HPV 亚型。

1.2 其他病因 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)靶向攻击CD4+T 细胞，导致严重的免疫功能受损。HIV 阳性宫颈癌占HIV感染相关性肿瘤中的14.4%，仅次于淋巴瘤而居HIV 相关性肿瘤的第二位，居女性HIV 相关性肿瘤的第一位［5，6］。提示我们在对这类患者进行抗肿瘤治疗的同时，应采取免疫辅助治疗，更好地改善其预后。

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)是人类主要组织相容性复合体(MHC)位于6号染色体上(6p21.31)的表达产物，具有高度多态性，主要负责细胞间相互识别、诱导免疫反应和调节免疫应答的功能。有研究表明，HLA 的基因多态性是HPV 感染和宫颈病变的危险因素，免疫调节可能在其中发挥了关键性的作用，但仍需进一步研究确定［7］。

流行病学研究发现，HPV 相关肿瘤的发展和生殖道沙眼衣原体感染有关，其可能通过损伤宫颈黏膜屏障、降低病毒清除率、减少下生殖道抗原呈递细胞、抑制细胞介导的免疫反应、抗凋亡等机制，导致HPV 持续感染甚至宫颈癌变［8］。此外，统计学研究发现，久坐的女性患CIN 的风险增加，坚持体育锻炼的女性患CIN 的风险降低［9］。原因可能在于体育锻炼能提高机体的免疫能力，从而更好地抵御HPV 的感染。因此应当提倡女性合理安排坐姿时间并保持终生规律的体育锻炼。

2 免疫学发病机制

机体免疫系统能够识别肿瘤细胞表面表达的肿瘤抗原产生免疫应答，引起效应细胞的激活和释放一系列效应分子，攻击和清除肿瘤细胞、抑制肿瘤生长。在抗肿瘤的细胞免疫应答中，T 细胞尤其是CD8+T(CTLs)介导的细胞毒效应发挥着主要作用。T 细胞通过TCR 识别MHC 提呈的抗原肽，启动信号转导通路，产生特异性免疫应答。一方面通过CTL 介导特异性细胞裂解作用，另一方面通过Th1细胞介导迟发性超敏反应。当机体免疫功能下降，无法有效识别、清除“异己”成分或突变细胞时，就可能发生肿瘤。为探讨HPV 感染对宫颈癌局部免疫功能的影响，一项研究选取医院2004 年8 月～2010 年8 月收治并确诊HPV 感染的283 例女性患者，分为宫颈癌组109 例及CIN 组174 例，对比其宫颈局部免疫功能，发现宫颈癌组白细胞计数、免疫球蛋白、TNF-α、INF-γ、IL-6 及IL-10 水平等较CIN 组显著降低，提示持续HPV 感染可导致机体免疫机能下降，使局部免疫功能耗竭，是影响其生存质量的主要原因［10］。

在某些情况下，肿瘤能够通过多种机制逃避机体免疫系统的攻击，如肿瘤细胞免疫原性下降、产生血清封闭因子、CD4/CD8 倒置、Th1/Th2 漂移、分泌免疫抑制因子等［11］。此外，有研究表明HPV16 E5蛋白通过影响表皮生长因子受体信号转导途径及环氧化酶2(COX-2)途径的活性，增加宿主细胞的免疫逃避，促进肿瘤细胞增殖、减少凋亡，促进肿瘤新生血管的形成等机制影响宫颈癌的发生与发展［12］。免疫缺陷是高危型HPV 感染持续存在的重要特点，抗原耐受、宿主防御不可逆损害、HPV 抗原特异性效应细胞无法到达感染中心，导致宫颈上皮HPV 大量表达E6 和E7 蛋白。Stanley 等［13］在研究中避开感染中心，采取肌肉注射高效预防性HPV L1 VLP的方式，从而启动强大的免疫反应，产生高浓度的L1 特定血清中和抗体，增强机体免疫力，有效防止病毒经上皮逃避。

3 免疫治疗与预防

随着细胞分子生物学和免疫学的发展，免疫治疗成为了宫颈癌的一种新的治疗模式。肿瘤免疫治疗主要通过提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，借助生物制剂的作用，回输免疫细胞和效应分子到体内，协同机体免疫系统，不仅能杀灭体内残存的微小癌细胞，还能防止肿瘤的转移和复发。因此，无论是早期、中期还是晚期宫颈癌，都可以通过免疫治疗获得理想治疗效果。肿瘤疫苗是免疫治疗的重要代表，目前用于宫颈HPV 感染的疫苗主要分为预防性疫苗和治疗性疫苗两大类。

3.1 预防性疫苗 HPV 感染是一种全身性疾病，HPV 相关妇科恶性肿瘤的控制，关键在于预防。目前，接种疫苗是预防这些疾病最可靠的手段。预防性疫苗主要通过重组DNA 技术表达L1 或L1 和L2蛋白，组装成病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，激发体液免疫应答，诱导机体产生中和性抗体，特别是黏膜分泌型IgA，从而预防HPV 感染。由于VLPs 只含病毒抗原，不含病毒DNA，不会导致病毒感染，使用较安全。由美国FDA 认证上市并已被世界多个国家接受的第一代预防性疫苗:Cervarix疫苗(美国葛兰素史克公司研制，二价)，为包含HPV16、18 的VLPs;Gardasil 疫苗(美国默沙东公司研制，四价)，为包含HPV16、18、11、6 的VLPs。

3.1.1 适应症及副作用 Cervarix 疫苗主要用于宫颈癌前病变和宫颈癌的预防，而Gardasil 疫苗用于预防生殖器疣、不典型性病变、癌前病变及癌症。最新全球癌症预防设想能够通过对感染HPV 的年轻女性接种这两种疫苗来预防HPV 相关疾病的发生［14］。美国FDA 批准男女性均可接种Gardasil 疫苗，女性注射Gardasil 疫苗可预防HPV16 型和18 型引起的宫颈癌、外阴阴道癌、肛门癌和HPV6、11 型引起的生殖器疣，男性则用于预防生殖器疣和肛门癌;但Cervarix 疫苗只用于年轻女性，用于预防HPV16 和18 型引起的宫颈癌。上述两种疫苗上市以来，相关临床试验报道的大多数不良反应事件都不严重，主要包括注射部位疼痛、头痛、恶心、发热、晕厥等，耐受性良好，且抗体效价比自然感染HPV患者显著提高［15］。有研究分析，HPV 四价疫苗具有较高的注射不良反应发生率，但均属于疫苗接种常见免疫反应［16］。Deleré 等［17］人对接种疫苗的功效进行系统文献评价和荟萃分析，HPV16、18 疫苗接种后，长期观察并未发现抗病毒能力消失，但长期保护力比短期稍弱。目前，Cervarix 疫苗和Gardasil疫苗的技术已基本成熟，但由于其价格昂贵、需低温保存等因素，极大地限制了其在发展中国家的推广。

3.1.2 接种方案 由美国卫生部管辖的免疫实践咨询委员会(ACIP)于2014 年最新发布的HPV 疫苗指南，推荐:11～12 岁女孩应接种HPV 疫苗(二价或四价);11～26 岁女性，未开始或未完成全程HPV 疫苗注射的应予以免疫;11～12 岁男孩应接种四价HPV 疫苗;13～21 岁男性，未开始或未完成全程三剂HPV 疫苗注射的，应注射四价疫苗进行免疫;两种疫苗最早可提前到9 岁注射;疫苗接种方案分三次注射，第二剂与第一剂间隔1-2 个月，而第三剂在首剂注射后6 个月接种。

此外，Boxus 等［18］人用酶联免疫吸附实验(ELISA)测量抗原-抗体反应的亲和力，发现二剂和三剂接种方案的抗体反应质量相似，对9～14 岁的女孩也可采取Cervarix 疫苗二剂接种方案。这一实验提示，对于9～14 岁的少女，Cervarix 疫苗的临床方案可有两种:6 个月内注射三剂(0、1、6 月)，或6个月内注射两剂(0、6 月)。

3.1.3 第二代预防性疫苗 随着第一代HPV 预防性疫苗技术的成熟，第二代疫苗也已进入临床试验，其主要靶向HPV L2，可诱导更多的中和抗体，进而阻止更多HPV 亚型的感染［19］。然而，优化L2 抗原决定簇使其更好的被免疫系统识别以及降低生产和销售成本，是目前设计第二代疫苗的难题。在三期临床研究中，Merck 等［20］人最新研究的HPV 疫苗V503 能预防97%高分期、癌前病变的外阴、阴道、宫颈疾病(由HPV31、33、45、52、58 亚型导致);该疫苗对HPV6、11、16、18 亚型也有效，甚至效果比现有的Gardasil 疫苗更有效，能通过诱导中和抗体来预防感染，是监视疫苗生产、效能以及诱导免疫反应的有力工具。提示我们应该在目前疫苗的基础上，重组更多的致瘤性HPV 亚型(HPV31、33、45、52、58型)，即构建九价疫苗，从而扩大相关肿瘤的预防范围，使其更好地为临床服务。但由于该疫苗还处在三期临床研究，所以相关的安全性问题尚缺乏数据支持。

3.2 治疗性疫苗 由于预防性疫苗对已感染HPV人群无效，因此研制HPV 治疗性疫苗成为近年来相关疾病研究领域的热点。HPV 治疗性疫苗的主要类型包括:HPV 载体疫苗、多肽疫苗/蛋白疫苗、基因疫苗、细胞疫苗等。由于高危型HPV 的E6、E7蛋白是公认的转化蛋白及肿瘤排斥抗原，在宫颈癌组织中有较高的表达，故成为研究最多的靶抗原。

3.2.1 作用机制 载体疫苗用有效的病毒或细菌作为载体，融合HPV 靶抗原，注入机体内后可产生特异性的CTL 反应，从而削减肿瘤细胞;具有高度免疫原性和载体类型可选择性等优点。多肽疫苗/蛋白疫苗是将HPV 靶抗原与人HLA 型相配的多肽片段直接输注到体内以诱导CTL 反应，从而杀伤肿瘤细胞;具有特异性高、安全性强和易于生产的优点，但其免疫原性较弱且具有HLA 限制性。基因疫苗是把编码特定抗原的基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA 直接注射到体内，刺激机体产生抗原特异的免疫反应;制备简单、性质稳定，且无MHC 限制性，可反复免疫，但其免疫原性较弱。细胞疫苗，如树突状细胞(DC)疫苗，荷载HBV 靶抗原，可表达高水平的MHC 分子和B7、CD40 等共刺激分子，启动CD4+和CD8+T 细胞反应。杨爱珍等［21］人解读美国FDA 行业指南的主要内容并指出:肿瘤治疗性疫苗的作用机制不同于细胞毒药物，其特殊之处在于诱导特异性抗肿瘤免疫反应须经一定的时间，才能转化为临床效应;并且复发或转移的患者通常都接受了多轮治疗，可能影响免疫系统，降低疫苗疗效。因此是选择晚期肿瘤患者，还是选择少瘤负荷或缓解期无明显残留灶的患者，需要我们权衡其中的利弊。

可见，现阶段HPV 治疗性疫苗的发展仍面临着一些挑战。首先，不同于HPV 预防性疫苗，治疗性疫苗需要在机体刺激出有效细胞免疫应答才能发挥作用。DC 作为一种抗原提呈细胞，是体内唯一能激活T 细胞免疫的细胞。如果HPV 感染部位缺乏细胞因子的产生，可妨碍DC 细胞的活化和成熟，从而抑制正常细胞免疫应答的激发，所以在HPV 相关肿瘤局部增加DC 数量可明显抑制肿瘤进展。但使HPV 相关肿瘤能逃避机体免疫攻击，所以这一技术的成熟仍有待深入评估才能获得新的突破。其次，调节性T 细胞(Treg)产生的免疫抑制也是目前宫颈癌免疫治疗面临的瓶颈。CD4+CD25+Foxp3+Treg在维持自身抗原的免疫耐受中起重要作用。有研究报道，CIN 和宫颈癌患者外周血中Treg 水平增高，可导致免疫功能障碍，清除HPV16+宫颈癌患者体外CD25+T 细胞可使抗HPV16 E6 和E7 蛋白T 细胞应答增加［22］。这对宫颈癌治疗性疫苗今后进一步的研制有着重要意义。

3.2.2 临床研究新进展 目前有一些治疗性疫苗已用于临床前期及临床试验，并在临床前期显示了极好的有效性。虽然在最初临床试验中很少获得成功案例，但近期研究获得了一些较好成果。有研究者对VGX-3100(经EP 产生的HPV DNA 疫苗)的安全性、耐受性和免疫原性进行评价，结果发现VGX-3100 疫苗的安全性和耐受性良好，不仅能诱导强烈而持久的体液免疫反应，而且能诱导有效的HPV 特异性Th1 细胞免疫反应，促进CD8+T 细胞向CTL表型转化，提示VGX-3100 可使高危HPV 血清型产生有力的免疫反应，有助于消除HPV 感染性细胞和促进发育不良细胞的逆转［23］。2014 年6 月，生物科技公司Inovio 制药宣布其旨在消除宫颈癌癌前病变的试验药物VGX-3100 在中期试验中达到主要终点，该公司的数据表明，用药患者中，49.5% 的CIN2/3 患者可恢复至CIN1 水平甚至疾病信号消失，相比之下，安慰剂组的这一比例为30.6%，这一结果具有明显的统计学意义。

Sugiyama 等［24］人的前期研究结果显示接受过放疗的局部晚期宫颈癌患者使用低剂量(0.2 microg)的免疫调制剂Z-100 比使用高剂量(40 microg)获得更好的总生存期(OS)，此次他们进行了一项以安慰剂为对照的三期临床双盲随机试验:将249 位IIB-IVA 期宫颈鳞癌病人随机分配并按计划给予Z-100 0.2 microg(Z 组)或安慰剂(P 组)，观察总生存期(OS)、无瘤生存和毒性，发现死亡事件发生极其慢于预期，虽然统计功效低于预期(两组的存活率比预期的高)，但是Z-100 能改善局部晚期宫颈癌的总生存期。Phippen NT 等［25］人进行的一项三期临床试验，用以评估贝伐单抗治疗复发性、长期或晚期宫颈癌患者的成本效益，通过比较标准化疗方案和由“标准疗法+贝伐单抗”组成的实验方案，发现总生存期(OS)与贝伐单抗呈正相关，并且当每1 个质量调整生命年增加155 美元时，在标准化疗的基础上增加贝伐单抗能达到共同的成效比，提示了适度降价贝伐单抗的价格或使用小剂量就能显著改变其可购性。此外，有研究者还提出贝伐单抗联合化疗能显著提高IVB 期、复发或者长期卵巢癌患者的缓解率、无疾病进展存活期和总体生存期，是第一个能够改善妇科癌症生存期的靶向药物，能给那些不肯接受根治性治疗的患者提供更多的治疗方案，并有望能改善其预后［26，27］。

Rosales 等［28］研究者为了评估MVA E2 重组痘苗病毒用于治疗上皮内瘤变伴随HPV 感染性疾病的有效性，进行了一项三期临床试验研究，试验招募了1 176 名女性和180 名男性患者，予以局部(生殖器或者肛门)注射MVA E2 疫苗，观察各项组织和免疫指标，发现1 051 名(89.3%)女性患者病变完全消除，28 名(2.4%)病变退到CIN1，另97 名(8.3%)治疗后发现孤立的凹空细胞;男性患者所有上皮内瘤变均完全消失;所有接受MVA E2 疫苗治疗的患者均能产生抗体及产生特异性细胞毒性免疫反应，83%患者治疗后HPV DNA 消失。这些数据提示MVA E2 疫苗是治疗性疫苗极好的代表，局部应用可激活免疫系统并使上皮内瘤变病变消退。现阶段国内外已经开展HPV 治疗性疫苗的临床研究，试验效果显示着HPV 治疗性疫苗的诱人前景。但在成功上市之前，HPV 治疗性疫苗仍有一些亟待解决的问题，如怎样提高疫苗的安全性和免疫原性等。

4 结语

综上所述，宫颈癌病因复杂，但与HPV 的关系明确;以疫苗为代表的免疫治疗虽然正在进行临床前或临床试验，但都朝着良好的方向不断发展。在不久的将来，治疗性疫苗的现有难题得到攻克之后，将对宫颈癌的预后产生重大改善;而预防性疫苗也不断扩大对抗HPV 感染的保护范围，有效地降低世界范围内宫颈癌发病几率，使患者能更好地延长生存期和提高生存质量。因此，随着对宫颈癌病因和致病机制的深入探索以及疫苗制备的逐渐完善，在不远的将来子宫颈癌将能够实现全面预防和根除，将不再是全世界女性生命中的威胁。

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