BTLA 及其负性调节慢性HBV 感染的研究进展①

郑怡娟 余雪平 苏智军 (福建医科大学附属泉州第一医院感染科，泉州 362000)

淋巴细胞的活化依赖于双信号的共同刺激，其中第一信号由抗原特异性受体T 细胞受体(TCR)或B 细胞受体(BCR)与抗原结合产生;第二信号由共刺激分子或共抑制分子介导产生。共刺激分子和共抑制分子统称为共信号分子，分别行使正向激发作用和负向调节功能，两者发挥协同作用，共同维持机体的平衡［1］。共信号分子按照结构可分为两大家族:一类是免疫球蛋白(Ig)超家族(或称B7/CD28 超家族)，包括CD28、ICOS、CTLA-4、PD-1 和BTLA(B and T lymphocyte attenuator);一类是肿瘤坏死家族(TNF)/TNF 受体(TNFR)超家族［2］，包括4-1BB、CD27、CD30、HVEM 和OX40。BTLA 是继PD-1、CTLA-4 后发现的第三个CD28 家族新成员［3］，其配体并非B7 家族成员，而是TNF 家族的HVEM(Herpesvirus entry mediator)，打破了同种家族受体只与同一家族配体结合的观点。研究表明，与PD-1、CTLA-4 一样，BTLA 同样具有抑制T 细胞反应及细胞因子产生的作用。在对乙肝病毒(HBV)感染的研究中也发现BTLA 在病毒特异性T细胞上高表达，对T 细胞增殖活性、分泌细胞因子功能等均具有强烈的抑制作用。现就BTLA 及其配体的生物学特性及其在慢性HBV 感染中的作用进行综述。

1 BTLA 的结构、分布与配体

1.1 BTLA 的生物学特性 BTLA 是2003 年由Watanabe 等［4］在基因筛选的研究中发现的一个在Th1细胞上表达的具有抑制功能的CD28 家族新成员，即CD272。Hansen 等［5］研究证明，鼠类的BTLA 基因定位于16 号染色体B3-5，其蛋白结构与CTLA-4和PD-1 相似，包括胞外区域、跨膜区和1 个胞质区。而人类的BTLA 基因则位于3 号染色体3q13 上，是一种由289 个氨基酸组成的I 型跨膜糖蛋白，人类与鼠类BTLA 的同源性为48%。BTLA 的胞质区包含三个高度保守的酪氨酸基序［6］，一个蛋白生长因子受体结合蛋白2(Grb2)潜在结合位点，一个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和一个免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)。当BTLA 与配体结合磷酸化后，ITIM 序列便可募集酪氨酸磷酸酶SHP-1 和SHP-2，从而介导免疫抑制功能［7］。BTLA 在脾脏、胸腺和淋巴结中大量表达，而在肝、肾、肺、心、脑等器官中表达较少，甚至检测不到。与CTLA-4、PD-1一样，BTLA 不仅表达于CD4+T 细胞、B 细胞，还表达于DC、巨噬细胞和NK 细胞等［8，9］。

1.2 BTLA 的配体-HVEM 的生物学特性 BTLA 的配体HVEM 属于TNFR 表面分子家族，不仅表达于外周血T 细胞和B 细胞(在静止T 细胞、未成熟B细胞和记忆B 细胞中高表达，在活化的T、B 细胞中表达下调)，而且还广泛表达于单核细胞、未成熟树突状细胞、调节性T 细胞(Treg)、中性粒细胞以及NK 细胞［10，11］。HVEM 可与TNF 家族成员(LIGHT和LT-α)和Ig 相关膜蛋白家族成员(BTLA、HSVgD)结合而发挥不同的免疫调节作用。HVEM 与LIGHT 或LT-α 结合发挥正向激发的作用，不仅刺激T 细胞和B 细胞的增殖与活化，而且具有诱导炎症反应和为T 细胞活化提供第二刺激信号的作用［12］;HVEM 与BTLA 结合则产生负向调节功能，抑制淋巴细胞的活化与增殖;HVEM 与HSV-gD 的结合可促进HSV 感染靶细胞［13］。总而言之，HVEM与不同配体结合后，提供抑制信号或活化信号，双向调节宿主免疫功能。

2 BTLA 在免疫细胞中的作用

2.1 BTLA 在T 细胞中的作用

2.1.1 诱导T 淋巴细胞的耐受 早期研究发现，BTLA 可以作为胸腺阳性选择的早期标志。BTLA在胸腺内主要表达于发生阳性选择的T 细胞中，随着野生型小鼠体内CD4-CD8-T 细胞向CD4+CD8+T 细胞转变，BTLA 表达逐渐增高，并持续表达于CD4/CD8 单阳性T 细胞中［14］。Watanabe 等［15］研究免疫耐受诱导实验发现，BTLA 基因敲除(BTLA-/-)小鼠对抗原口服耐受和高剂量鸡卵白蛋白(OVA)静脉注射诱导的免疫耐受具有抵抗性。同年，Watanabe 等［16］研究发现BTLA-/-小鼠能够自发打破免疫耐受，最终导致类似自身免疫肝炎疾病和同时出现炎性细胞浸润多个器官的结局。Liu等［17］研究发现，同样口服抗原无法诱导BTLA-/-小鼠产生免疫耐受，与野生型OT-Ⅱ细胞相比，当用大剂量OVA 刺激时BTLA-/-的OT-Ⅱ细胞诱导产生耐受更具有抵抗性，体外实验进一步验证了BTLA在诱导T 细胞外周免疫耐受的过程中起重要作用。

2.1.2 抑制T 淋巴细胞的活化 最初研究表明，BTLA 可能通过与HVEM 胞膜远侧的CRD1 结合，抑制抗原特异性TCR 信号介导的T 细胞增殖以及CD25 的表达，减少IL-2、IL-4、IL-10 的产生，从而介导免疫抑制功能及调节细胞因子的产生［18］。随后的研究发现，用低剂量抗CD3 作用于CD4+T 细胞时，BTLA 能够抑制T 细胞增殖，而当高剂量的抗CD3 作用时，BTLA 的抑制效应就消失了［19］。另有研究表明，BTLA 也可通过与Treg 细胞上的HVEM结合来发挥免疫抑制效应功能［20］。

在某些情况下，BTLA 与配体HVEM 结合后不仅介导免疫抑制功能，还可能向效应T 细胞传递正性信号来促进它们的存活［21］。Tarun 等［22］用牛痘病毒感染小鼠的实验中发现，在抗病毒过程中CD8+T 细胞的BTLA-HVEM 共信号系统能够显著促进抗病毒效应T 细胞的存活及记忆细胞的产生。Suto 等［23］研究BTLA 在Tfh 细胞的作用时发现，与wild-type(WT)CD4+细胞相比，BTLA-/-CD4+T 细胞中的Tfh 细胞上的IL-21(介导的IgG 的表达)的数目显著性增加，提示BTLA 可通过抑制Tfh 细胞中IL-21 的产生来抑制IgG 的表达，在T 细胞依赖性的体液免疫调节中发挥重要的作用。

2.2 BTLA 在B 细胞中的作用 目前关于BTLA 功能的研究主要集中在其对T 细胞的免疫抑制作用，而BTLA 对B 细胞的作用机制研究较少，故人们对BTLA 在B 细胞中的作用知之甚少。最近Marie-Laure 等［24］认为，BTLA 与HVEM 介导的信号途径可抑制CG 二核苷酸(CPG)介导B 细胞的功能(包括增殖、细胞因子的产生和上调协同刺激分子)，而对BTLA 信号途径封闭后可增强其增殖活性及细胞因子的产生，但BTLA 并不影响IL-8H 和MIP1β 的表达，表明BTLA 只是部分抑制B 细胞的功能。

Vendel 等［25］用绝对量化质谱分析法定量测量磷酸化蛋白酪氨酸激酶Syk，验证了BTLA 与HVEM结合后能抑制B 细胞增殖，可募集酪氨酸磷酸酶Src 并减弱BCR 下游信号强度，并发现BCR 信号下游的分子，包括B 细胞连接蛋白(B cell linker protein)、磷脂酶ε2(Phospholipase C-gamma 2)、核转录因子-κB(NF-kappaB)等分别出现下调及核移位。以上结果表明BTLA 是BCR 信号通路上的一个抑制性受体，通过作用于BCR 下游的信号分子Syk 以及B 细胞连接蛋白发挥作用。

2.3 BTLA 在树突状细胞(DC)中的作用 最近研究发现，HVEM-BTLA 信号在维持DC 的内环境稳态方面也发挥重要作用。Kirsten 等［26］研究发现，HVEM-BTLA 信号可反馈调节淋巴毒素(LT)受体信号以维持DC 内环境的稳定。当用受体激动剂强力激活LT-βR 可驱使CD8α-DC 的扩增，但此时严格受到HVEM-BTLA 信号的调节，表明HVEM-BTLA信号通路可为DC 稳态的维持提供一个抑制性信号，并且可以上调DC 中B7-1 的表达。研究者发现BTLA 修饰的DC 可以对大鼠移植肝脏起到免疫保护作用，经BTLA 修饰的供体DC 细胞迁移到受体组织内，能够抑制肝移植急性排斥反应，并延长移植肝和受体大鼠存活时间［27］。

3 BTLA 在慢性HBV 感染中的作用

近年来，BTLA-HBVM 信号通路在自身免疫性疾病、肿瘤的发展、移植排斥和病毒感染等疾病中发挥重要的作用［28-32］。但BTLA 在慢性病毒感染性疾病，尤其是慢性HBV 感染中的研究目前仍较少。慢性HBV 感染是一个世界性的公共问题，我国HBV感染者众多，且大多数为慢性感染，并最终可发展为肝衰竭(LF)、肝硬化(LC)和原发性肝癌(HCC)。目前认为T 淋巴细胞在抵御HBV 入侵及清除HBV感染中发挥着重要的作用。但HBV 入侵会引起T淋巴细胞功能缺陷及效应细胞数量减少，即T 淋巴细胞功能耗竭，导致HBV 持续感染。目前T 淋巴细胞耗竭机制仍不十分清楚，但已有的研究表明，机体内在的抑制性微环境在T 淋巴细胞的功能耗竭中扮演着重要的角色，其中负性共刺激分子起了举足轻重的作用。在慢性病毒感染动物的实验模型中表明，PD-1 的表达上调可作为T 淋巴细胞耗竭的重要标志［33］，而BTLA 在T 淋巴细胞功能耗竭中的作用及其在HBV 慢性感染中的作用目前仍鲜有报道。

最近研究发现，BTLA 与PD-1 共表达于慢性乙型肝炎(CHB)患者的肝组织T 淋巴细胞中，并显著抑制T 淋巴细胞功能，而对BTLA 信号途径封闭后可增强外周血单个核细胞(PBMC)和肝组织内T 淋巴细胞的增殖及细胞因子的分泌，使耗竭的T 淋巴细胞功能得到部分恢复［34］。另有研究表明，在HBV 感染病程进展的不同阶段(CHB、LC、HCC)，CD28、ICOS、LIGHT 的表达没有显著性的差别，而BTLA 和PD-1 在LC 和HCC 患者中的表达显著高于CHB 患者，表明BTLA 在在CHB 疾病进展中发挥重要的作用，为预防和治疗CHB 疾病进展提供新的方向和靶点，但其具体作用机制尚须进一步探索［35］。

通过流式细胞术分析健康者、乙肝后肝硬化(HBV-LC)及HCC 患者外周血中BTLA 的表达，俞海蛟等［36］研究发现BTLA 在HCC 组中高表达，并与CD4+CD25+T 细胞呈正相关，提示BTLA 可能通过CD4+CD25+T 细胞的协同作用，抑制T 细胞的增殖，进而参与肿瘤免疫逃逸。通过药物消除BTLA的活性，抑制T 细胞的免疫功能，从而“唤醒”机体免疫系统对肿瘤的识别，进而清除肿瘤细胞，这可能成为一种新的治疗肿瘤的免疫方法。

LF 是慢性HBV 感染的不良结局，HBV 相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)是在急性肝衰竭中发生率、死亡率最高的疾病，所以确定更多的诊断指标对于早期诊断该病是很有必要的。Xu 等［37］通过免疫组织化学的方法分析了HBV-ACLF 患者、CHB 患者及健康者肝组织中的BTLA 的表达，发现BTLA 在CHB 及健康者的肝组织中未测及，而在HBV-ACLF患者的肝组织纤维白细胞素(FGL2)和纤维蛋白中大量表达与沉积;此外HBV-ACLF 患者的肝组织中可见大量CD68+细胞浸润，而这些细胞高表达BTLA。以上结果表明BTLA 有望成为诊断HBV-ACLF的新标记物，也将为HBV-ACLF 的免疫治疗带来新的策略。

4 结语

随着对BTLA-HVEM 信号通路研究的不断深入，BTLA 的免疫应答作用及调控机制将日益明朗。目前大量动物实验模型表明，BTLA 在自身免疫性疾病、肿瘤、移植、感染等疾病中发挥重要的免疫调节作用，为预防和治疗疾病提供新的方法和靶点。但目前为止，BTLA 是否像CTLA-4、PD-1 一样，参与了T 淋巴细胞功能耗竭及调节慢性HBV 感染所引发的一系列疾病还知之甚少，但可以预见以BTLA为靶点的研究将在慢性HBV 感染的免疫机制、诊断及治疗方面引发一场新的革命。

［1］McGrath MM，Najafian N.The role of coinhibitory signaling pathways in transplantation and tolerance［J］.Front Immunol，2012，3:47.

［2］del Rio Maria-Luisa，Kaye Jonathan，Rodriguez-Barbosa Jose-Ignacio.Detection of protein on BTLAlow cells and in vivo antibodymediated down-modulation of BTLA on lymphoid and myeloid cells of C57BL/6 and BALB/c BTLA allelic variants［J］.Immunobiology，2010，215(7):570-578.

［3］Watanabe Norihiko，Gavrieli Maya，Sedy John R，et al.BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1［J］.Nat Immunol，2003，4(7):670-679.

［4］Gavrieli M，Watanabe N，Loftin SK，et al.Characterization of phosphotyrosine binding motifs in the cytoplasmic domain of B and T lymphocyte attenuator required for association with protein tyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，312(4):1236-1243.

［5］Bernard D，Hansen JD，Du Pasquier L，et al.Costimulatory receptors in jawed vertebrates:Conserved CD28，odd CTLA4 and multiple BTLAs［J］.Dev Comp Immunol，2007，31(3):255-271.

［6］Murphy Kenneth M，Nelson Christopher A，Sed John R.Balancing co-stimulation and inhibition with BTLA and HVEM［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(9):671-681.

［7］Sakoda Yukimi，Park Jang-June，Zhao Yuming，et al.Dichotomous regulation of GVHD through bidirectional functions of the BTLAHVEM path-way［J］.Blood，2011，117(8):2506-2514.

［8］Hurchla MA，Sedy JR，Gavrieli M，et al.B and T lymphocyte attenuator exhibits structural and expression polymorphisms and is highly Induced in anergic CD4+T cells ［J］.Immunology，2005，4(6):3377-3385.

［9］Pilat N，Sayegh MH，Wekerle T.Costimulalory pathways in transplantation［J］.Semin Immunol，2011，23(4):293-303.

［10］Nurieva RI，Chung Y，Hwang D，et al.Generation of T follicular helper cells is mediated by interleukin-21 but independent of T helper 1，2，or 17 cell lineages［J］.Immunity，2008，29(1):138-149.

［11］Steinberg MW，cheung TC，Ware CF.The signaling networks of the herpesvirus entry mediator(TNFRSFl4)in immune regulation［J］.Immunol Rev，2011，244(1):169-187.

［12］del Rio ML，Lucas C，Buhler L，et al.HVEM/LIGHT/BTLA/CD160 cosignaling pathways as targets for immune regulation［J］.J Leukoc Biol，2010，87(2):223-235.

［13］Sedy John R，Gavrieli Maya，Potter Karen G，et al.B and T lymphocyte attenuator regulates T-cell activation through interaction with herpesvirus entry mediator ［J］.Nat Immunol，2005，6:90-98.

［14］Han P，Goularte OD，Rufner K，et al.An inhibitory Ig su-perfamily protein expressed by lymphocytes and APCs is also an early marker of thymocyte positive selection ［J］.J Immunol，2004，172:5931-5939.

［15］Oya Yoshihiro，Watanabe Norihiko，Kobayashi Yoshihisa，et al.Lack of B and T lymphocyte attenuator exacerbates autoimmune disorders and induces Fas-independent liver injury in MRL-lpr/lpr mice［J］.Int Immunol，2011，23:335-344.

［16］Oya Yoshihiro，Watanabe Norihiko，Owada Takayoshi，et al.Development of autoimmune hepatitis-like disease and production of autoantibodies to nuclear antigens in mice lacking B and T lymphocyte attenuator［J］.Arthritis Rheuma，2008，58 (8):2498-2510.

［17］Liu x，Alexiou M，Martin-Orozco N，et al.Cutting edge:A critical role of B and T lymphocyte attenuator in peripheral T cell tolerance induction［J］.J Immunol，2009，182(8):4516-4520.

［18］Han P，Goularte OD，Rufner K，et al.An inhibitory Ig superfamily protein expressed by lymphocytes and APCs is also an early marker of thymocyte positive selection ［J］.J Immunol，2004，172:593I-5939.

［19］Otsuki N，Kamimura Y，Hashiguchi M，et al.Expression and function of the B and T lymphocyte attenuator(BTLA/CD272)on human T cells ［J］.Biochem Biophys Res Cornmun，2006，344:1121-1127.

［20］Tao R，wang L，Muphy KM，et al.Regulatory T cell expression of herpesvirus entry mediator suppresses the function of B and T lymphocyte attenuator-positive effector T cells［J］.J Immunol，2008，180(10):6649-6655.

［21］Sakoda Yukimi，Park Jang-June，Zhao Yuming，et al.Dichotomous regulation of GVHD through bidirectional functions of the BTLAHVEM pathway［J］.Blood，2011，117:2506-2514.

［22］Flynn Rachel，Hutchinson Tarun，Murphy Kenneth M，et al.CD8 T cell memory to a viral pathogen requires trans cosignaling between HVEM and BTLA［J］.PloS One，2013，8:e77991.

［23］Kashiwakuma Daisuke，Suto Akira，Hiramatsu Yukiko，et al.B and T lymphocyte attenuator suppresses IL-21 production from follicular Th cells and subsequent humoral immune responses［J］.J Immunol，2010，185:2730-2736.

［24］Marie-Laure Thibult，Jean-Paul Rivals，Emilie Mamessier，et al.CpG-ODN-induced sustained expression of BTLA mediating selective inhibition of human B cells ［J］.J Mol Med，2013，91(2):195-205.

［25］Vendel AC，Calemine-Fenaux J，Izrael-Tomasevic A.B and T lymphocyte attenuator regulates B cell receptor signaling by targeting Syk and BLNK［J］.J Immunol，2009，182(3):1509-1517.

［26］De Trez Carl，Schneider Kirsten，Potter Karen，et al.The inhibitory HVEM-BTLA pathway counter regulates lymphotoxin receptor signaling to achieve homeostasis of dendritic cells［J］.J Mmunol，2007，180(1):238-248.

［27］马 毅，叶智明，李彦杰，等.BTLA 负性共刺激分子修饰树突状细胞对大鼠移植肝脏的免疫保护作用［J］.中华实验外科杂志，2011，28(8):1327-1330.

［28］Sedy JR，Gavrieli M，Potter KG，et al.B and T lymphocyte attenuator regulates T cell activation through interaction with herpesvirus entry mediator［J］.Nat Immunol，2005，6(1):90-98.

［29］Fourcade J，Sun Z，Pagliano O，et al.CD8(+)T cells specinc for tumor antigens can be rendered dysfunctional by the tumor microenvironment through upregulation of the inhibitory receptors BTLA and PD-1［J］.Cancer Res，2012，72(4):887-896.

［30］Ch T，Liu YG，Yan JK，et al.B-and T-lymphocyte attenuator/herpes virus entry mediator as early indicators for acute rejection following kidney transplantation［J］.Transplant Proc，2013，45:157-162.

［31］Serriari NE，Gondois-Rey F，Guillaume Y，et al.B and T lymphocyte attenuator is highly expressed on CMV-specific T cells during infection and regulates their function［J］.J Immunol，2010，185:3140-3148.

［32］胡斯文，张子宁，何 磊，等.HIV 早期和慢性感染者不同亚群T 细胞BTLA 的表达［J］.中国免疫学杂志，2011，27(7):657-661.

［33］Hyun-Tak Jin，Yun Hee Jeong，Hyo Jin Park，et al.Mechanism of T cell exhaustion in a chronic environment［J］.BMB REP，2011，44(4):217-231.

［34］Cai G，Nie X，Li L，et al.B and T lymphocyte attenuator is highly expressed on intrahepatic T cells during chronic HBV infection and regulates their function［J］.J Gastroenterol，2013，48(12):1362-1372.

［35］Chen J，Wang L，Fu Y，et al.The co-inhibitory pathway and cellular immune imbalance in the progress of HBV infection［J］.Hepatol Int，2014，81:55-63.

［36］俞海蛟，李 洁，沈 茜，等.原发性肝癌患者外周血淋巴细胞及其亚群B、T 淋巴细胞衰减子表达的研究［J］.浙江医学，2012，(19):1563-1565.

［37］Xu H，Cao DY，Guo GN，et al.The Intrahepatic Expression and Distribution of BTLA and its Ligand HVEM in patientis with HBV-related acute-on-chronic liver failure ［J］.Diagnostic Pathol，2012，7:142.