细胞毒性T 淋巴细胞活性检测方法进展

石秀敏 牛 超 李 敏 金浩范 (吉林大学第一医院肿瘤中心，长春 130021)

细胞毒性T 淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)活性的测定是了解机体细胞免疫功能的重要方法。肿瘤免疫治疗中使用肿瘤表位分子使特异性的CTL 激活并扩增，达到清除肿瘤细胞的目的［1］，抗病毒多表位DNA 疫苗也在快速发展［2］，这些研究中CTL 的定性和定量检测非常重要，因此如何更好地检测CTL 活性成为一个关键的问题。近年来，许多新的评估CTL 活性的方法得到发展，本文就此做以综述。

1 第一代检测方法

第一代CTL 活性的检测方法是数十年前发展起来的，主要包括抗原刺激后的增殖实验以及检测细胞毒性的51Cr 释放实验。这两种实验均在整个细胞群体水平评价CTL 的活性，需要预先体外扩增，所以T 细胞活性的检测依赖于细胞的增殖潜能，实验结果受体外刺激过程的影响很大，限制了其在检测体内免疫活性方面的敏感性及应用。

1.1 CTL 增殖实验 常用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)及3H 胸腺嘧啶核苷掺入法。前者的基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为不溶于水的紫色结晶甲瓒(formazan)，甲瓒的生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲瓒，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。后者的原理是前体T 细胞受到特异性抗原刺激后增殖，具有放射性的3H-TdR 可作为合成DNA 的原料而摄入细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量，就能客观地反映前体T 细胞对抗原的应答水平。但上述方法实验周期较长，且不能检测失能的T 细胞，可能使检测值偏低。

1.251Cr 释放实验 Na251CrO4能进入到增殖的细胞内，与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记了51Cr的细胞死亡后，即可释放出51Cr。51Cr 辐射γ 射线，通过测定死亡靶细胞释放到上清中的51Cr，即可计算出效应细胞活性。该方法曾被认为是细胞毒性检测的“金标准”，但因其敏感性差、标记率低，并存在同位素污染问题，目前已经较少使用。

1.3 Calcein-AM 荧光法 Calcein-AM 是一种可对活细胞进行荧光标记的染色试剂，本身无荧光，穿透细胞膜进入到细胞质后，酯酶会将其水解为绿色荧光物质Calcein(钙黄绿素)。当效应细胞作用于靶细胞，死亡的靶细胞细胞膜通透性增加，Calcein 就会释放到细胞培养液中，通过检测细胞培养液中的荧光，即可获得效应细胞对靶细胞的杀伤率。不足的是Calcein-AM 在高浓度时可能损害细胞功能，且可发生荧光淬灭，影响检测结果的准确性。

2 第二代检测方法

近十年发展起来的第二代体外CTL 活性的检测方法明显改善了我们检测T 细胞活性的能力，这些方法是基于单个细胞水平的检测，并且提供了细胞的量化结果。

2.1 HMC 四聚体法 对某一抗原而言，其特异性T 细胞的TCR 库是有限制性的，因此可利用基于TCR 结构特征的方法来检测某一特定抗原的CTL的克隆的信息［3］。1996 年，Altman 等首次用主要组织相容性抗原复合物(MHC)Ⅰ类分子、抗原肽和荧光染料标记联接蛋白组成的单体物通过亲和素铰链成为四聚体复合物，用来检测具有特定TCR 的CTL。该法避免了体外培养增殖或同位素杀伤过程，只需合成复合物就可进行定量检测，检测到的T细胞数量比常规方法要高10 倍，且可通过流式细胞仪分选将特异性CTL 从淋巴细胞群中分离纯化出来。其主要限制因素包括已知的确定的表位、针对各自表位/HLA 等位基因的合适四聚体、四聚体非特异性结合以及不能提供细胞功能方面的信息等。

2.2 检测细胞因子及细胞毒性颗粒 活化的CTL分泌功能性细胞因子和细胞毒性颗粒，如IL-2、IFNγ、TNF-α、穿孔素、颗粒酶等，通过检测细胞因子的分泌情况可反映T 细胞的活性，但是只有产生细胞因子的特异性T 细胞亚型才能被检测到，并且肿瘤特异性T 细胞所分泌的细胞因子量通常低于病毒特异性的T 细胞，也可能低于ELISPOT 方法的检测范围。此外，功能分析对实验条件的变化很敏感，非特异性细胞因子的分泌可能限制这些方法的灵敏度。

2.2.1 酶联免疫斑点法(Enzyme-linked immunosorbent spot assay，ELISPOT) CTL 受抗原刺激后一旦分泌功能性细胞因子，就被预包被的抗体直接捕获，通过局部形成的斑点数目得出分泌细胞因子的T细胞频数，从而反映抗原特异性CTL 的活性。该方法灵敏度和特异性均很高，且所需T 细胞数量较少，节约临床样本，但此法也有一定的局限性，如果T 细胞无功能或分泌其他的细胞因子，就有可能低估CTL 的数量，另外除了CTL、NK 细胞等也可分泌相同的细胞因子，故还需结合细胞表型的分析［4］。Malyguine 等［5］分别对GrB ELISPOT 法、IFN-γ ELISPOT 法和51Cr 释放法进行了比较，结果显示三者的相关性较好，并且GrB ELISPOT 法与51Cr 释放法的反应性非常接近，比IFN-γ ELISPOT 法和四聚体法更快速更直接。

2.2.2 细胞内细胞因子染色法 ELISPOT 法间接地提供分泌某种细胞因子的CTL 数目，而细胞内细胞因子染色法则可以提供更直接、更准确的信息。1993 年，Jung 等采用莫能星(Monesin)等药物预孵的方法，阻断胞内高尔基体介导的细胞因子转运，使其在细胞内蓄积，然后应用两种免疫荧光抗体分别标记CTL 表面的亚群标志分子和胞内细胞因子，用流式细胞仪进行检测和分析，即可得到不同T 细胞亚群某一细胞因子的分泌情况。最近 Mitzi Donaldson 等［6］利用8 色细胞内细胞因子染色法，定量测定了临床前疫苗研究中恒河猴的T 细胞反应。结果显示，该方法具有很高的重复性，并且在组间、操作者之间及不同时间上的变异很低，是临床前免疫原性检测的一个标准方法［7］。

3 第三代检测方法

第三代CTL 活性的检测方法提供了更全面的T细胞表型和功能信息。这些分析方法可以多方面提供T 细胞活性的信息，包括T 细胞杀伤效应、增殖以及迁移潜能等。

3.1 Caspase 抗体标记凋亡靶细胞 T 细胞受体识别靶细胞表面的MHC-抗原肽复合物后，CTL 即可释放穿孔素及粒酶或者激活Fas/FasL 信号通路，靶细胞继发caspase 瀑布级联反应，从而发生凋亡，其中caspase-3 是一个重要的凋亡指示蛋白，在凋亡发生的早期就可以被激活。He 等［8］利用细胞示踪染料DDAO-SE 标记P815、EL4 和T2 淋巴瘤细胞，并用caspase-3 抗体对凋亡细胞染色。结果证明，该方法用于检测一些人和鼠的抗原特异性CTL 活性是安全、可靠的。Chahroudi 等报道，利用可穿透细胞膜的荧光标记caspase，检测CTL 诱导的靶细胞caspase 激活，比传统的51Cr 释放法更快、更安全、更敏感，能在单个细胞水平检测靶细胞，并可与其他检测方法同时进行。CTL 通过释放穿孔素和粒酶以及激活FasL 和TRAIL 诱导细胞凋亡，但二者在作用时间上不同，Hassin 等［9］通过抗体荧光标记caspase-8 激活和BID 的裂解，解释了其原因是这两种机制是同时跳跃式开始的，而FasL 的溶解作用滞后，所以caspase 抗体标记靶细胞是一个很敏感的反映凋亡的方法。

3.2 Annexin V 标记凋亡靶细胞 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)是一种磷脂，正常情况下分布在细胞膜内侧，细胞凋亡时外翻到细胞表面，可与外源性的Annexin V 高亲和力结合，从而区分细胞是否发生凋亡。Goldberg 等将效应细胞与靶细胞共孵育后，用PE 结合效应细胞特异性单克隆抗体并标记效应细胞，不能与PE-mAb 结合的细胞即为靶细胞，再用FITC 标记的Annexin V 来检测细胞凋亡时出现在细胞表面的PS。结果显示，该方法与51Cr释放法在检测细胞毒性方面有明显相关性。

3.3 PI 或7-AAD 标记死亡靶细胞 评价靶细胞死亡的方法中应用最广泛的是检测DNA 嵌入荧光剂的摄取，如PI，可因死亡靶细胞膜通透性增加而进入细胞内，与DNA 嵌合。已经有很多方法联合荧光染料和DNA 嵌入染料来直接鉴别死亡细胞，特别是Annexin V-FITC/PI 双染法，已被广泛用于区别细胞凋亡与死亡。例如，Ozdemir 等［10］将靶细胞和效应细胞用特异性的单克隆抗体染色，用Annexin V 和PI 组合来区分凋亡/死亡细胞。Sun［11］和Yang等［12］也使用Annexin V-FITC/PI 双染法来区分凋亡/死亡细胞，结果证明这种方法是有效的，毫不逊色于51Cr 释放法，且更快、更容易操作。

7-AAD 是一种最常用的PI 替代物，也可以穿透死细胞的细胞膜，插入到核酸的双链中，研究证明死亡的靶细胞摄取7-AAD 和PI 的水平几乎相同。被荧光标记的Annexin V 与靶细胞膜结合，同时加入PI 或7-AAD，可以检测细胞凋亡，并在单细胞水平上区分细胞凋亡的不同阶段。Lecoeur 等［13］也通过标记效应细胞来区分效应细胞和靶细胞。用CFSE来标记效应细胞，在CFSE 阴性的靶细胞群中，用Annexin V-7AAD 来鉴别凋亡细胞和坏死细胞。也有学者用PKH67 标记靶细胞，Annexin V-PE 和7-AAD 评估死亡细胞［14］，结果显示，流式细胞仪检测靶细胞死亡率和51Cr 释放法所得结果之间有明显相关性。

该方法简单、可靠，应用广泛，但是不能区分晚期凋亡细胞和坏死细胞，而且必须要用活细胞来检测，对细胞的活性要求较高，应该是状态最好的时候进行检测。

3.4 溶酶体相关膜糖蛋白(LAMPs)抗体标记效应细胞脱颗粒 细胞毒颗粒，即粒酶和穿孔素是膜包被的溶酶体，CTL 通过胞吐作用将其释放后介导细胞死亡。包绕细胞毒颗粒的脂质双层结构包含溶酶体相关膜糖蛋白(Lysosomal-associated membrane glycoproteins，LAMPs)，包括CD107a (LAMP-1)、CD107b (LAMP-2)和CD63 (LAMP-3)。CTL 在适当的刺激下，微管发生移动，将颗粒运送到CTL 的质膜，随后质膜发生融合，粒酶和穿孔素被释放到突触中，继而发生脱颗粒［15］，导致靶细胞死亡。在脱颗粒过程中，溶酶体膜和细胞膜融合的结果是，溶酶体膜表面的糖蛋白可表达于细胞表面，溶酶体相关膜糖蛋白(LAMPs)抗体与其结合，可标记效应细胞脱颗粒过程。

流式细胞仪检测CD8+T 细胞上CD107a 和CD107b 的表达作为一种可靠的临床监测方法，已获得越来越多的认可。例如，Wang 等［16］人通过流式细胞仪检测细胞膜上CD107a 的表达，建立了一种可量化评价NK 细胞及CTL 细胞毒性的方法，结果证明该方法可以快速、有效的筛查细胞毒性缺陷相关的疾病，如家族性噬血细胞淋巴组织增生综合征及其他原发性免疫缺陷继发的疾病。Yoshikawa等［17］在Glypican-3 (144-152)肽疫苗治疗进展期的肝细胞癌患者的I 期临床试验中，用Dextramer 和CD107a 抗体对Glypican-3 (144-152)肽特异性CTL细胞进行单个细胞分选，建立了很多Glypican-3(144-152)肽特异性CTL 克隆，并证明了Glypican-3(144-152)肽疫苗诱导的CTL 能高效的识别并杀伤表达Glypican-3 的肝细胞癌细胞。

3.5 其他方法 CTL 被激活后通过表达TRAIL 和Fas-L 与靶细胞表面的相应受体分子结合，启动信号转到途径而诱导凋亡，故CTL 表面TRAIL 及Fas-L 的检测，可以反映其活化程度和杀伤能力［18，19］;CTL 细胞因子受体及粘附抗原的检测，可反映其迁移能力［20］;CFSE 稀释法可反应细胞的增殖能力;CTL 对稀释后不同浓度抗原的反应，提示TCR 与特异性抗原的亲和力;抗原标记的树突状细胞在体内的存活也可反映CTL 的活性，等等。

4 展望

CTL 活性检测在鉴定CTL 优势表位、评估疫苗效果、预测移植排斥反应等方面有重要的意义，各种检测CTL 活性的方法已广泛应用于实验研究和临床研究，这些方法各有特点，研究者可根据具体需要进行选择，其中随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现，荧光测定法将有可能取代传统的方法，而微量和直接测定体内CTL 活性的方法将为细胞免疫研究开辟新路。

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