胎儿卵巢的形态学及细胞凋亡的观察与研究

王永霞 伍园园马娜 钟兴明 崔蓉 王小兰 杨宁 苗竹林

1.广东省计划生育科学技术研究所，广东广州510600；2.同济大学附属第一妇婴保健院生殖中心，上海200204；3.广东药学院基础医学院生理学系，广东广州510006

胎儿卵巢的形态学及细胞凋亡的观察与研究

王永霞1伍园园2马娜3▲钟兴明1崔蓉1王小兰1杨宁1苗竹林1

1.广东省计划生育科学技术研究所，广东广州510600；2.同济大学附属第一妇婴保健院生殖中心，上海200204；3.广东药学院基础医学院生理学系，广东广州510006

目的探讨人胎儿卵泡的发育形成过程及卵细胞凋亡情况。方法收集2013年1～12月于广东省计划生育科学技术研究所行中期妊娠及晚期妊娠（24～32周）引产的女性胎儿卵巢组织18例。其中24～27周（孕中期）胎儿卵巢组织8例，28～32周（孕晚期）胎儿卵巢组织10例。采用免疫组化苏木精-伊红（HE）染色及原位末端标记法（TUNEL），观察胎儿卵巢卵泡发育及形成过程及该过程中卵细胞凋亡情况。结果HE染色显微镜下观察，孕中期胎龄卵巢原始卵母细胞较多，卵巢间质少，颗粒细胞较少。随着胎龄的增加，颗粒细胞逐渐增多；围绕卵母细胞，原始卵泡逐渐形成并开始增多，卵母细胞数量减少。孕晚期原始卵母细胞明显减少，原始卵泡形成，数量进一步增多，随着孕龄增加，原始卵泡愈发完整。TUNEL染色观察见阳性凋亡细胞多见于未形成卵泡的卵母细胞，卵细胞周围的颗粒细胞在孕晚期可见少许凋亡，卵泡内卵细胞未见阳性染色。孕中期卵巢卵母细胞凋亡明显多于孕晚期，且凋亡主要发生于未形成原始卵泡的卵母细胞。结论胎儿卵巢发育过程中，原始卵母细胞数量逐步减少，原始卵泡形成，其发育过程中原始卵母细胞不断发生凋亡，导致生殖细胞丢失。

胎儿卵巢；卵母细胞；细胞凋亡

在女性妊娠8周的女性胚胎卵原细胞开始增殖，妊娠20周左右达到峰值，之后开始进入减数分裂期。在由有丝分裂向减数分裂过渡时，细胞数目急剧下降，大量丢失[1]。初级卵母细胞继续发育，此时它们被来自卵巢壁的前颗粒细胞所包围，形成原始卵泡，这期间卵母细胞仍在不断死亡，有三分之二的卵母细胞在出生前已被丢失[2]。大量实验证明，哺乳动物生殖细胞在发生过程中的大量死亡或丢失属于细胞凋亡[3-4]。但到目前为止人胎儿卵巢发育的相关研究较少，因此对于其发育过程中细胞凋亡的发生及机制的认识还很少，凋亡因子在卵巢内细胞定位、发生时相以及相互作用尚未完全阐明，调控卵母细胞凋亡的途径尚不清楚，这一切均有待进一步的深入研究。本研究采用苏木精-伊红染色（HE）观察胎儿卵巢发育，使用原位末端标记法（TUNEL）检测胎儿卵细胞凋亡，旨在探讨胎儿卵巢发育过程中卵细胞形成过程及卵细胞凋亡，为进一步研究卵细胞凋亡机制及其调控提供线索。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2013年1～12月由于母亲或社会因素于广东省计划生育科学技术研究所（以下简称“我院”）行妊娠终止的病例，所有患者均采用米非司酮联合前列腺素进行引产。收集孕24～32周引产的女性胎儿卵巢组织18例。其中24～27周（中期妊娠）胎儿卵巢8例，28～32周（晚期妊娠）胎儿卵巢10例。本研究经我院医学伦理委员会讨论通过，收集的胎儿卵巢组织也均得到胎儿母亲的同意并签署知情同意书。

1.2 方法

卵巢组织投入10%福尔马林溶液固定，经脱水、浸蜡、包埋。最终切成3μm石蜡切片。石蜡切片经脱蜡浸水后，常规HE染色后显微镜下观察胎儿卵巢组织。细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行，用荧光显微镜拍照后，二氨基联苯胺-过氧化氢显色，设立阳性对照（用DNA酶处理切片）和阴性对照（用PBS代替末端脱氧核糖核酸转移酶）。结果判断：荧光显微镜下阳性细胞呈黄绿色荧光，二氨基联苯胺（DAB）显色后阳性定位于细胞核，或细胞核、细胞浆同时着色，呈棕黄色。

2 结果

2.1 HE染色结果观察

显微镜下观察，24～27周胎龄卵巢原始卵母细胞较多，颗粒细胞少，且大部分并未围绕卵母细胞形成原始卵泡，但是随着胎龄的增加，颗粒细胞围绕卵母细胞数目增多，原始卵泡形成开始增多。27～28周胎龄，已有部分原始卵泡形成。28～32周胎龄原始卵母细胞明显减少，颗粒细胞增多，原始卵泡形成。随着孕龄增加，原始卵泡愈发完整。见图1（封三）。

2.2 凋亡细胞观察

阳性凋亡细胞的细胞标记为黄绿色荧光小体，主要见于未形成卵泡的卵母细胞及早期原始卵泡。卵泡越成熟，凋亡发生越少见。孕中期卵巢卵母细胞明显多于孕晚期，且凋亡主要发生于未形成原始卵泡的卵母细胞（图2，封三）。部分孕晚期的胎儿卵巢中，凋亡主要发生于颗粒细胞（图3，封三）。

3 讨论

卵泡发育是一个多阶段的复杂过程，在妊娠11～12周时卵原细胞开始向初级卵母细胞转化，在妊娠20周时卵母细胞总数达高峰，然而，有2/3的卵母细胞在出生前被丢失[2]。因此，细胞凋亡是卵巢功能和发育过程中不可或缺的组成部分。细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，凋亡在生物胚胎发生、器官形成发育、成熟细胞新旧交替、激素依赖性生理退化以及自身免疫性疾病和肿瘤等的发生发展中都发挥着不可替代的重要作用。卵泡的凋亡可能发生于卵母细胞或颗粒细胞，最终导致卵泡闭锁。有学者认为，原始卵泡、初级卵泡闭锁主要是由卵母细胞凋亡引起，而在生长卵泡中，颗粒细胞的凋亡起主导作用[5]，但也有学者认为两种凋亡同时发生于卵泡生长发育的任何一个阶段[6]。

本研究发现，孕中期（24～27周）胎儿卵巢发育与孕晚期（28～32周）胎儿卵巢有明显区别。在孕中期胎儿卵巢组织，主要由多量的原始卵母细胞密集排列构成，卵母细胞较小，核圆形深染，胞浆不多，颗粒细胞较少，卵巢间质不明显。随着孕龄的增加，颗粒细胞增多，逐渐围绕原始卵母细胞，形成原始卵泡。在孕27～28周的胎儿卵巢中，已可见部分原始卵泡形成，卵巢间质开始增多。在孕晚期胎儿卵巢，原始卵母细胞明显减少，多数已被颗粒细胞包绕，随着孕龄增加，原始卵泡体积增大，卵母细胞核圆形，增大，胞浆丰富红染，围绕颗粒细胞增多，卵巢间质增多，血管增生。随着孕龄增加，卵母细胞进一步减少，仅剩形态结构清晰的原始卵泡。TUNEL染色发现，细胞凋亡主要存在原始卵母细胞，颗粒细胞也存在凋亡现象。随着孕龄增加，卵巢发育进一步成熟，原始卵泡形成，数目逐渐减少，凋亡细胞相应减少，且主要发生于颗粒细胞。说明在胎儿卵巢发育过程中，卵母细胞的数量持续减少，原始卵泡形成，在这个过程中，细胞凋亡起着至关重要作用。从而提示对于原始卵泡形成阶段，卵细胞的减少多由于卵细胞本身的凋亡，而对于原始卵泡形成后，卵泡闭锁可能基于颗粒细胞的凋亡。

近年来，对人胎儿卵巢细胞凋亡的研究已取得一些进展，有研究者[7]利用TUNEL法观察孕中、晚期胎儿卵细胞，发现部分卵细胞出现阳性反应，即发生凋亡，而且孕中期胎儿卵细胞凋亡发生率明显高于孕晚期，且发现Caspase-3在胎儿卵细胞内广泛表达，而且与卵细胞凋亡呈正相关，提示Caspase-3可能参与卵细胞凋亡的调控。另外，胎儿早期卵泡的颗粒细胞内未见Caspase-3表达，TUNEL法检测亦未见阳性颗粒细胞，提示早期卵泡闭锁始于卵细胞凋亡。De Pol等[8]采用TUNEL法观察到了孕18～20周的人类胚胎卵巢内典型的凋亡细胞形态，并且还证实，这个时期的胚胎中只有生殖细胞发生了凋亡。这与本实验结果一致。说明在人胎儿卵巢的发育过程中，在卵细胞的选择性发育成熟过程中，细胞凋亡起着关键作用。

女性卵母细胞储备量一出生就已确定，在女性一生中只有少数卵泡能完成排卵。妇女在其成年期大约可以排400个卵母细胞[9-10]，在早期卵泡闭锁过程中，卵母细胞首先发生凋亡，卵泡颗粒细胞由内层向外层逐渐凋亡；而生长晚期的卵泡，颗粒细胞首先凋亡，诱导卵母细胞凋亡，触发了卵泡闭锁[11]。胎儿时期卵母细胞的凋亡、每个卵泡周期非优势卵泡的清除以及植入前胚胎细胞的凋亡，均保证了卵巢、卵泡、卵母细胞和胚胎的正常发育，为获得优秀后代提供了保障。卵巢内卵母细胞及颗粒细胞的凋亡不仅是引起卵泡闭锁的原因，而且凋亡与卵巢正常或异常的功能相关。卵巢颗粒细胞的凋亡就是卵巢早衰发病的主要原因[12]。有学者从不同角度对其病因进行了研究，无论从组织水平、分子水平，还是基因水平，都发现有颗粒细胞的凋亡[13-16]。

因此，研究卵巢卵母细胞与颗粒细胞凋亡，对改善和提高女性生育能力，保持卵巢功能有重要意义。尤其是对人胎儿卵巢发育过程、卵泡凋亡和闭锁的机制研究，将为最终实现对人卵泡发育的调控提供线索，将有助于了解卵母细胞发育机制。通过人为诱导，延缓或促进卵母细胞凋亡，开发利用卵巢内卵泡资源有重要意义，可为女性生殖系统疾病、辅助生殖技术提供基础研究方向，有重大的理论意义和广泛应用价值。

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Observation and research of morphology and apoptosis in fetal ovary

WANG Yongxia1WU Yuanyuan2MA Na3▲ZHONG Xingming1CUI Rong1WANG Xiaolan1YANG Ning1MIAO Zhulin1
1.Guangdong Family Planning Institute of Science and Technology,Guangdong Province,Guangzhou 510600,China; 2.Reproductive Center,Shanghai First Maternity and Infant Hospital,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200204,China;3.Department of Physiology,Basic School of Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Province,Guangzhou 510006,China

ObjectiveTo investigate the development and apoptosis of the oocyte during human fetal development.MethodsOvarian tissues from 18 fetuses(aged 24-32 weeks)from January 2013 to December 2013 in Guangdong Family Planning Institute of Science and Technology were obtained,including 8 fetuses aged 24-27 weeks(midpregnancy)and 10 fetusesaged 28-32 weeks(late-pregnancy).The morphology and developmentofoocyte and the occurrence ofoocyte apoptosis during human fetal follicular development were examined using HE-staining and TUNEL method.ResultsMicroscope observation after HE-staining,the ovarian tissues in the midpregnancy had more oocytes than the late-pregnancy,less ovarian stroma and granulosa cells.The granulosa cells increased gradually,and primordial follicles grown up and began to accumulate around the oocytes during human fetal development,while the number of oocytes decreased. The number of original oocytes decreased significantly in late-pregnancy,Primordial follicle grown up and began to accumulate with the increase of gestational age,primitive follicles more complete.TUNEL stained showed that,apoptotic cell was easily found in follicular oocytes that had not formed the follicle,granule there were a few apoptotic cells around egg cells in the late-pregnancy,no egg cell in follicle was positive stained.The number of apoptotic cell in midpregnancy was more than late-pregnancy,and apoptosis mainly happened on the oocytes that had not formed a primordialfollicle.ConclusionThe originaloocytes become less during the human fetalfollicular development,it is caused by the oocyte apoptotosis,the original follicular is formed in the fetal ovar of the late-pregnancy.

Fetal ovarian;Oocyte;Apoptosis

R735.7

A

1673-7210（2015）07（b）-0149-03

2015-03-20本文编辑：任念）

广东省人口计生委科研课题项目（20110202）。
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