复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂对大鼠睾丸毒性的机制研究

董正谋，刘鲁川，敖 琳

(1.湖北省红安县人民医院口腔科，湖北红安 438400;2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所口腔科，重庆 400042;3.第三军医大学预防医学院卫生毒理学教研室，重庆 400038)

复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂对大鼠睾丸毒性的机制研究

董正谋1，2，刘鲁川2，敖 琳3

(1.湖北省红安县人民医院口腔科，湖北红安 438400;2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所口腔科，重庆 400042;3.第三军医大学预防医学院卫生毒理学教研室，重庆 400038)

目的:观察复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星(COPM)牙周缓释制剂对大鼠睾丸毒性的作用机制。方法:将40只SD雄性大鼠随机分为阴性对照组和低、中、高剂量组(n=10)，每日分别按1、4、8g/kg-1的剂量灌服COPM牙周缓释制剂，阴性对照组每日按体质量灌服相应体积的双蒸水，连续42d。所有大鼠处死后，分别计算附睾系数，检查精子计数、活动率和畸形率;透射电镜观察生精细胞的超微结构;考马斯亮蓝法测定睾丸组织中乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)的活力;RT-PCR检测睾丸组织中雄激素结合蛋白(ABP)、抑制素-α(inhibin-α)基因的mRNA表达水平。结果:高剂量组睾丸、附睾系数减小，精子活力降低、计数减少、畸形率增加(P＜0.05)，生精细胞超微结构出现不同程度损害;高剂量组睾丸组织中的LDH、LAL、ACP和高、中剂量组的γ-GT活力降低;高剂量组睾丸组织中的ABP和inhibin-α mRNA表达水平下降(P＜0.05)。结论:高剂量COPM牙周缓释制剂对大鼠睾丸有一定的毒性;睾丸组织中LDH、ALP、ACP、γ-GT的活力下降，ABP和inhibin-α mRNA的表达减少可能是其毒性作用机制之一。

牙周缓释制剂;睾丸;超微病理;组织酶;基因表达

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25(6):354］

牙周病是一种病因复杂的微生物感染性疾病，在世界范围内均有较高的发生率。可疑致病菌直接或间接作用于牙周组织或其他组织器官后，可引起一系列损害和症状，并严重影响患者的生理和心理健康。在牙周病治疗中，药物的应用占有非常重要的位置;随着现代医学和生物材料学的发展，结合缓控释制剂的优点将药物局部应用于牙周已成为牙周病治疗的一种全新、有效的治疗方法［1］。COPM牙周缓释制剂是根据牙周病的发病机制并结合缓控释制剂的优点而研制的新药，本课题组在前期试验中已证实其具有较好的抑菌效果，发现临床设计剂量(远低于低剂量组制剂)对大鼠睾丸无毒性作用，且高剂量制剂对大鼠睾丸有一定毒性［2-3］。本研究通过进一步观察该制剂对大鼠睾丸的毒性，并探讨其毒性作用机制，以期为临床应用提供实验室依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

SPF级SD(sprague-dawley rats)雄性大鼠［合格证号:SCXKC(渝)2007-0005，第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心］;复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂(10 mg/枚，自制);考马斯亮蓝测试盒、乳酸脱氢酶 (lactatedehydrogenase，LDH)试剂盒、碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)试剂盒、酸性磷酸酶 (acid phosphatase，ACP)试剂盒、γ-谷氨酰转肽酶 (γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT)试剂盒(南京建成生物工程研究所);柱式小量总RNA抽提试剂盒(上海华舜生物有限公司);Reverse transcription system A3 500、GoTaqgreen master mix M7 122(Promega，美国);7 200型可见光分光光度计(Unic，美国);全波长酶标测定仪(赛默飞，美国);TECNAI-10透射电子显微镜(飞利浦，荷兰);ND 1 000型核酸蛋白分析仪(Thermo，美国);PCR仪(Bio Rad，美国);VDS-CL型凝胶成像系统(GE，美国);高速低温离心机(贝克曼，美国);XBK-25型血球计数板(上海求精生化试剂有限公司);AV-560生物显微镜(OLYMPUS，日本)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和给药

取11～13周龄体质量为(200±20)g雄性SD大鼠40只，适应性饲养1周，并观察其活动、饮食等无异常后，随机分为阴性对照组和低、中、高剂量组(n=10)，每组分笼喂养。饲养条件:清洁级动物房，温度(22±3)℃，相对湿度50%～60%，人工照明，12 h光照，12 h黑暗，饲以标准颗粒饲料，自由饮水。饲养期间，低、中、高剂量组每日分别按体质量1、4、8g/kg-1的剂量灌服复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂(1、4、8g/kg-1折合原料药0.1、0.4、0.8g/kg-1，相当于成人全口牙用量的156.25、625、1 250 倍)，阴性对照组每日按体质量灌服相应体积的双蒸水。每天灌服1次，连续灌服42d后称重，并处死所有大鼠。

1.2.2 睾丸、附睾系数和精子活动率、计数、畸形率的观察

分离睾丸、附睾，分别称其质量后按以下公式计算睾丸、附睾系数:睾丸(或附睾)系数=双侧睾丸(或附睾)质量(g)/体质量(g)×100。取出附睾，置于2 mL、37℃生理盐水中剪碎，并混匀成精子悬液后，分别进行以下检测:①取精子悬液，置于37℃水中孵育15 min后，室温(26℃)下观察200个精子的活动情况(10 min内完成)，并计算精子的活动率:活动率(%)=活动精子数/200×100%;②取精子悬液置于60～80℃水浴中使其死亡后，取1滴悬液滴于血细胞计数板中，并用红细胞计数的方法计数精子数:精子数=悬液精子数×稀释倍数/单侧附睾质量;③取精子悬液1滴，推片、晾干，并用甲醇溶液固定5 min后，10g/L伊红溶液染色1 h后;自来水冲洗，高倍镜下观察每只大鼠1 000个精子中发生畸形的精子数(香蕉形、胖头、双头、无沟、尾折迭、双尾、无定形)，并计算其畸形率:精子畸形率(%)=畸形精子总数/1000×100%。

1.2.3 睾丸生精细胞的超微结构观察

在冰台盒上预先注入4℃ 25 mL/L戊二醛固定液，迅速将睾丸置于固定液中，并以锋利刀片迅速切割成1 mm×1 mm×1 mm的组织块后，继续固定。固定结束后，常规制作透射电镜标本，并在透射电镜下观察生精细胞的超微结构。

1.2.4 睾丸组织酶活力的测定

睾丸去被膜、血管，并准确称重后，立即置于一定体积的冰生理盐水中，并在冰浴条件下研磨成匀浆;然后低温离心取上清，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，并按试剂盒操作说明测定 LDH、ALP、ACP、γ-GT的活力。

1.2.5 睾丸雄激素结合蛋白(ABP)、抑制素-α(inhibin-α)基因的检测

用柱式小量总RNA抽提试剂盒提取各组大鼠睾丸组织的总mRNA，并将其逆转录成cDNA。在Genebank中分别搜寻ABP、Inhibin-α mRNA序列，并用Primer-6引物设计软件设计引物，各引物序列如下:①ABP(286 bp)，Sequence:ATCAACTGCTTGGGGTTCAC，anti-sequence:GAGCCTGGTCAGAGGCATAG;②Inhibin-α(208 bp)，Sequence:GCTCTACCAGGGAGCATGAG，anti-sequence:CACCTTCCTCCTAGCTGACG;③β-actin(285 bp)，Sequence:TCATGAAGTGTGATGTGGATATCCGCAAAG，anti-sequence:TCTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGG。然后以cDNA为模板，β-actin为内参照，并按试剂盒说明构建PCR反应液体系后，用PCR仪对目的基因进行扩增。扩增条件为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55℃～60℃退火30 s(ABP、Inhibin-α退火温度为58℃，β-actin退火温度为60℃)，72℃延伸60 s，共30～35次循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经凝胶电泳鉴定后，用凝胶成像系统进行成像，并扫描目标基因片段的灰度，进行半定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组睾丸、附睾系数和精子活动率、计数、畸形率的比较

高剂量组大鼠的睾丸、附睾重量减轻、系数减小，精子活动能力低下、数目减少，且畸形精子数增多;以上各指标分别与阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)(表1)。

表1 各组大鼠的睾丸、附睾系数和精子活动率、计数、畸形率比较(%，±s)

*与阴性对照组相比P＜0.05

组别 睾丸系数 附睾系数 精子活动率(×108)精子数 精子畸形率阴性对照组 1.1271 ±0.0024 0.3718 ±0.0038 86.45 1.17 ±0.17 2.89低剂量组 1.1267 ±0.0023 0.3717 ±0.0033 86.55 1.15 ±0.16 2.93中剂量组 1.1266 ±0.0021 0.3712 ±0.0035 85.95 1.15 ±0.19 3.14高剂量组 1.0178 ±0.0029* 0.3659 ±0.0036 74.45* 0.87 ±0.18* 5.72*

2.2 睾丸生精细胞的超微结构观察

阴性对照组:曲细精管结构完整，细胞排列紧密(图1a);精原细胞核膜平滑，常染色质呈颗粒状，胞浆线粒体密度中等，细胞器未见异常(图1b);初级精母细胞细胞器丰富，线粒体密度中等，核大而圆、膜清晰(图1c);精子细胞呈长梭形，核仁明显，核染色质致密而均质(图1d)。高剂量组:曲细精管结构紊乱，细胞疏散(图2a);精原细胞核膜不清晰，染色质偏集，线粒体肿胀、空泡化(图2b);初级精母细胞核膜内陷，线粒体肿胀，嵴混乱，部分内质网增生，脱颗粒(图2c);精子细胞肿胀明显，核膜部分缺少，染色质浓缩不良，部分精子头部萎缩或畸形(图2d)。中、低剂量组的生精细胞超微结构与阴性对照组相比，基本上无变化(图从略)。

图1 阴性对照组睾丸生精细胞的超微结构(透射电镜)

图2 高剂量组睾丸生精细胞的超微结构(透射电镜)

2.3 各组睾丸组织的酶活力比较

睾丸组织中各酶的含量均随给药剂量的增加而呈下降趋势，其中高剂量组的LDH、ALP、ACP和中、高剂量组的γ-GT下降最明显，分别与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)(表2)。

表2 各组睾丸组织的酶活力(U.g-1protein)比较(±s)

表2 各组睾丸组织的酶活力(U.g-1protein)比较(±s)

*与阴性对照组相比P＜0.05

组别 n LDH ALP ACP γ-GT阴性对照组 10 4864.12 ±440.79 129.44 ±17.37 107.51 ±18.01 46.72 ±6.41低剂量组 10 4699.64 ±687.39 120.17 ±23.55 103.07 ±28.03 48.41 ±9.61中剂量组 10 5110.31 ±638.41 115.13 ±25.42 99.02 ±26.65 31.63 ±8.94*高剂量组 10 3919.37 ±588.67* 88.47 ±19.98* 85.45 ±23.66* 27.19 ±7.78*

2.4 各组睾丸组织中ABP、inhibin-α mRNA表达水平比较

RT-PCR检测结果显示，高剂量组睾丸组织中ABP(图3)和inhibin-α(图4)基因的表达量均明显减少;经半定量分析，两者分别与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)(表3)。

图3 睾丸组织中ABP基因的表达

图4 各组睾丸组织中inhibin-α基因的表达

表3 各组睾丸组织中ABP、inhibin-α mRNA表达定量的比较(±s)

表3 各组睾丸组织中ABP、inhibin-α mRNA表达定量的比较(±s)

*与阴性对照组相比P＜0.05

组别 n ABP inhibin-α阴性对照组10 0.4954 ±0.1546 0.3828 ±0.0242低剂量组 10 0.4407 ±0.1434 0.3825 ±0.0262中剂量组 10 0.4419 ±0.1707 0.3782 ±0.0214高剂量组 10 0.3172 ±0.2037* 0.2855 ±0.0255*

3 讨论

牙周病是口腔疾病中的常见病和多发病，在世界范围内均有较高的发生率;其病因复杂，主要以G-菌和厌氧菌感染为主。牙周可疑致病菌的表面物质、毒素、酶、机械运动及代谢产物等不仅可直接或间接损伤牙周组织或其他组织器官，同时还能激发宿主的炎性免疫反应，并引起组织细胞变性坏死、牙周纤维破坏、牙槽骨吸收等一系列损害，从而导致牙龈出血、牙周溢脓、食物嵌塞、牙齿松动甚至脱落等症状［4］。有研究指出:牙周病与糖尿病［5］、心血管疾病［6］、消化系统疾病、动脉粥样硬化、类风湿疾病、妊娠和生殖［7］等密切相关。相对于牙周病药物治疗的全身应用、局部涂布、漱口和冲洗，结合缓控释制剂的优点并将药物局部用于牙周已成为牙周病治疗的有效途径之一［8］。COPM牙周缓释制剂是本课题组根据牙周病的发病机制，并结合缓控释制剂的优点而研制的新药，本研究通过观察该制剂对大鼠睾丸的毒性，并探讨其作用机制，以期为临床应用提供实验室依据。

睾丸和附睾是雄性生殖系统最主要的器官，其质量反映了生殖器官的功能和状态［9］。本研究结果显示，中、低剂量组大鼠的睾丸和附睾重量未见明显变化，而高剂量组则引起睾丸和附睾重量减轻，可能是高剂量制剂及其代谢产物影响了睾丸组织中某些物质的合成或代谢，从而造成其重量发生变化;但由于重量是评价体格发育的较好指标，并且与生殖密切相关，其具体机制还有待进一步阐明。活动度是精子运动的特征性指标，精子数量足够和形态正常是保证动物生育的最主要指标之一［10］。若精子活动能力不足、数目偏少、畸形偏多，其发生、分化、增殖和成熟、储存及受精等过程将会受到影响，并可直接导致不孕、不育等生殖系统相关疾病。本结果显示，中、低剂量组的精子活动率、数量及畸形率均未见明显变化;高剂量组的精子活动率、数量明显低于阴性对照组，畸形率则明显高于阴性对照组，提示高剂量制剂可能影响了精子发生、分化和成熟的内环境，从而导致某些物质合成增加或减少，并使细胞代谢障碍、功能紊乱甚至结构异常，最终导致其活动能力降低、数量减少和形态学异常。

睾丸是精子发生、分化和增殖的场所，从精原细胞到精子历经了一系列的过程;在精子发生、分化和增殖过程中，各级生精细胞除含有一般细胞器外，还含有丰富的线粒体和内质网，以保证精子发生、分化、成熟和良好的活动性［11-12］。本结果显示，中、低剂量组大鼠的睾丸生精细胞的超微结构基本无变化，而高剂量组曲细精管中的各级生精细胞在细胞层次、细胞器结构均出现不同程度的变化，说明细胞的结构和功能均受到了一定程度的损伤:细胞胞膜、核膜模糊，说明生物膜系统转运能力低下，出入胞作用下降，防御功能降低;线粒体损伤，说明细胞能量代谢障碍，动力机构受损;内质网受损，会使其合成、转化、解毒作用下降，并可进一步造成细胞损伤;染色质异常不仅可导致DNA转录、复制相对静止，还会使细胞功能低下，同时畸形率也会增加。睾丸是一种分化、发生非常活跃的组织，正常的超微结构是细胞行使功能学的基础，如超微结构损伤，可导致各级生精细胞分化、发生和成熟出现异常，并伴有结构和功能学的改变。与本实验中所观察到的睾丸、附睾重量减轻，精子活动性能降低、数目减少、畸形率增加相一致。

精子的发生、分化与成熟经历一系列复杂的过程，其结构和功能活动均有赖于睾丸组织中各种酶活性的维持。LDH可催化丙酮酸和乳酸的转化反应，并通过糖酵解生能，是生精能力的重要标志酶［13-14］。本结果显示，中、低剂量组的LDH活力与阴性对照组相比基本上无变化;而高剂量组的LDH活力则显著降低，并由此导致能量代谢障碍，继而影响精子的发生、分化、增殖和成熟等相关过程。ALP主要参与生殖细胞分化与增殖时营养物质的运输，ACP主要发挥清除受损或衰老细胞的功能［15］。本结果显示，中、低剂量组的 ALP、ACP活力基本上无变化;而高剂量组的ALP、ACP活力均显著降低，说明各级生精细胞的相关物质交换受到影响，同时细胞的吞噬和清除能力低下，并可继发细胞的进一步损伤和变化。γ-GT是睾丸支持细胞的特异性标志酶［16］，本结果显示，低剂量组的γ-GT活力基本上无变化;而中、高剂量组的γ-GT活力则明显受到抑制，表明睾丸支持细胞受到了损伤，其营养、支持、局部调节和防御功能也相应降低。

Inhibin是睾丸支持细胞分泌的糖蛋白激素，含有一个通用α亚单位和一个性质不同的β亚单位，并根据不同β亚单位将inhibin分为inhibinA(αβA)和 inhibinB(αβB);其可特异性地作用于腺垂体，并通过下丘脑-垂体-性腺轴负反馈调节激素的分泌，除了对FSH的分泌起抑制作用外，还可在曲细精管内减少精原细胞的有丝分裂［17］。ABP是睾丸支持细胞分泌的一种蛋白，与睾酮结合后可维持曲细精管局部睾酮的浓度，从而促进生精过程［18］。本结果显示，中、低剂量组睾丸组织中inhibin-α和ABP mRNA的表达量基本上无变化，而在高剂量组表达量则明显减少;表明高剂量组支持细胞相关功能受到了一定的影响，从而使inhibin-α和ABP合成下降，中枢性反馈调节作用减弱，细胞有丝分裂减少，睾酮浓度减少，局部生物学效应降低，生精启动作用受阻，精子的发生、分化和成熟受到抑制，并最终导致精子的活动性能、数目和形态学等发生了相关改变。

综上所述，高剂量COPM牙周缓释制剂对大鼠睾丸有一定的毒性，睾丸组织中 LDH、ALP、ACP、γ-GT的活力下降，以及 inhibin-α、ABP mRNA的表达量下降可能是其毒性作用机制之一。

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The study on testicular toxicity of compound ornidazole and pefloxacin mesylate of periodontal sustained release preparations on male rats

DONG Zheng-mou*，LIU Lu-chuan，AO Lin
(*Department of stomatology，People＇s Hospital of Hongan，Hong'an 438400，Chian)

AIM:To observe the testicular influence of compound ornidazole and pefloxacin mesylate(COPM)of periodontal sustained release preparation on male rats and related mechanism.METHODS:40 male SD rats weredivided into negative control，low，medium and highdosegroups by randomdigit table(n=10)and were feddaily with COPM of the preparation at 1，4 and 8g.kg-1respectively，those in the negativegroup were feddaily bydistilled water，continuously for 42d.The coefficient of testis and epididymis，motility，count anddeformity of sperm were examined，ultrastructural examination on sperm atogenic cells were respectively observed;LDH，ALP，ACP，γ-GT in testicular tissue weredetermined respectively，the mRNA expression of ABP and inhibin- α in testis was examtned.RESULTS:In highdosegroup the coefficient of testis and epididymis，motility，count anddeformity of sperm were alldecreased(P ＜0.05);ultrastructure was changed;LDH，ALP，ACP，γ-GT，ABP and inhibin-α were alldecreased(P ＜0.05).CONCLUSION:COPM of periodontal sustained release preparations at highdose has toxicity on testis of male SD rats，the reduction of LDH，ALP，ACP，γ-GT，ABP and inhibin-α in testis may be the cause of mechanisms.

periodontal sustained release preparation;testis;ultrastructural pathology;tissue enzymes;gene expression

R780.2

A

1005-2593(2015)06-0354-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.06.005

2014-11-10

重庆市科技攻关计划项目(CSTC2009AC5019)

董正谋(1973-)，男，汉族，湖北红安人。硕士，主治医师

刘鲁川，E-mail:liuluchuan1957@126.com

·临床研究·