HPLC法同时检测食醋中川芎嗪和阿魏酸的含量

李建龙,刘书亮,*,彭 杨,刘 军,杨 勇,韩新锋,侯晓艳,夏小龙,罗佩文,贾秋思

(1.四川农业大学食品学院,四川雅安 625014;2.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;3.四川保宁醋有限公司,四川阆中 645000)



HPLC法同时检测食醋中川芎嗪和阿魏酸的含量

李建龙1,刘书亮1,*,彭 杨1,刘 军2,杨 勇3,韩新锋1,侯晓艳1,夏小龙1,罗佩文1,贾秋思1

(1.四川农业大学食品学院,四川雅安 625014;2.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;3.四川保宁醋有限公司,四川阆中 645000)

本文建立了一种高效液相色谱法同时检测食醋中川芎嗪和阿魏酸的方法,其检测条件为:采用Sepax GP-C18柱,流动相:甲醇∶水(含0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v),检测波长310nm,柱温35℃,进样量10μL,1.0mL/min等梯度洗脱。结果表明:川芎嗪在1.00～60.00μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数R2=0.990,保留时间为14.71min;而阿魏酸在1.00～15.00μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为R2=0.997,保留时间为19.45min;该方法检测川芎嗪和阿魏酸的检出限分别为0.115、0.041μg/mL,测定限分别为0.383、0.135μg/mL;加标回收实验的结果得出川芎嗪的平均回收率为100.01%,阿魏酸的平均回收率为99.85%。该方法快速、灵敏、准确,样品前处理简便,可应用于食醋产品中川芎嗪和阿魏酸检测。

高效液相色谱法,阿魏酸,川芎嗪,食醋

食醋是日常生活中重要的调味品,其在我国的饮食文化中地位颇高,随着对食醋的深入研究,现已确定了食醋中含有相当丰富的营养物质,如蛋白质、氨基酸和碳水化合物(葡萄糖、麦芽糖等),其有机酸含量也较为丰富(除乙酸外,还有乳酸、柠檬酸、丙酮酸及琥珀酸等),同时食醋还含有维生素和矿物质[1-5]。近年来,科研人员对食醋中功能成分的研究日益加强,其中对川芎嗪(四甲基吡嗪,C8H12N2,Tetramethylpyrazine,TMP)和阿魏酸(又名肉桂酸,4-羟基-5-甲氧基苯丙酸,C10H10O4,Ferulic acid)等物质的研究较为深入[6-8]。川芎嗪和阿魏酸是已知的食醋中重要的风味物质[1,8-9],川芎嗪还作为食品添加剂,应用于相关加工食品中。阿魏酸和川芎嗪都具有抗血小板聚集,缓解血管痉挛,增加冠脉流量,改善微循环及增加脑血流量等作用[10-11]。

研究表明川芎嗪、阿魏酸已经成为食醋成分中的功能指标[12-13]。关于食醋中川芎嗪和阿魏酸的检测方法主要有薄层洗脱比色法[14]、薄层显色扫描法[15]及高效液相色谱法(HPLC)[16-18]等,且国内文献报道多为测定一种成分含量方法,费时费力,因此,建立一种同时检测食醋中川芎嗪、阿魏酸的方法非常必要。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

特级保宁醋 市售;川芎嗪、阿魏酸标准品 上海金穗生物科技有限公司(98%);甲醇(色谱纯) 广东光华科技股份有限公司。

其它试剂均为分析纯。LC-10A2010C HT型液相色谱仪、LC-solution工作站 日本岛津公司;AS10200A超声波清洗器 天津奥特赛恩斯公司;Milli-Q超纯水仪 美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 待测样品的提取 精确量取食醋5mL置于100mL具塞三角瓶中,用NaOH溶液调pH至8.5,按1∶4的比例加入40%乙醇提取溶剂。超声提取45min(40kHz,100W,40℃)[19],混匀后取5mL离心(12000r/min,10min),将上清液用有机相滤膜(0.45μm)过滤,弃去初滤液2mL,取续滤液0.5mL供高效液相色谱仪分析用[20]。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为Sepax GP-C18柱(150mm×4.60mm,5.0μm);流动相:甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v);流速:1mL/min;柱温:35℃;紫外检测器,波长:310nm;进样量:10μL。

1.2.3 样品的同步提取 川芎嗪是脂溶性物质,易溶于热水、石油醚,溶于氯仿、乙醇,稀盐酸,微溶于乙醚,不溶于冷水;阿魏酸易溶于热水,难溶于苯和石油醚[21]。由于两者都溶于乙醇,且乙醇方便易得,无毒无害[22],故采用乙醇作为提取溶剂;川芎嗪和阿魏酸易溶于热水,故提取过程在热水中进行,考察在20、40、60℃下样品的回收率,并在处理样品时探索在酸性和碱性环境下HPLC色谱图中杂质峰的数量,以此确定样品的同步提取的条件。

1.2.4 检测波长的确定 用甲醇(色谱纯)分别将川芎嗪和阿魏酸标准品溶解,制成质量浓度约为10μg/mL的溶液,在200～400nm的波长范围进行紫外光全波长扫描。

1.2.5 流动相的选择 阿魏酸为酸性化合物,易电离,在流动相中加入少量酸,可改善峰形,川芎嗪虽为碱性化合物,遇酸成盐,造成拖尾现象,但在酸性环境中的分离效果较好[19-20]。考察四种流动相甲醇∶水、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.1%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸)对阿魏酸和川芎嗪分离的影响(分配比为60∶40,v/v)[16],选择基线平稳、分离度好的流动相做进一步研究。

1.2.6 标准溶液的配制 分别精确称取川芎嗪、阿魏酸标准品1mg,用1mL甲醇(色谱纯)溶解,并分别配制成川芎嗪、阿魏酸浓度为60μg/mL和20μg/mL的标准品储备液。精密吸取储备液,将川芎嗪储备液稀释成浓度为60、50、25、12.5、10、5.0、1.0μg/mL,阿魏酸储备液稀释成浓度为15、10、5、3.3、2.5、2.0、1.0μg/mL,得到不同浓度的标准品供试液。用有机相滤膜(0.45μm)过滤,-4℃保存待用。按照上述色谱条件进行HPLC测定,分别以川芎嗪和阿魏酸质量浓度X(μg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。

1.2.7 检出限和测定限 检出限(detection limit)和测定限(determination limit)是对一种检测方法评价的重要指标。分别精确吸取储备液,将川芎嗪储备液稀释成浓度为0.01、0.02、0.04、0.06.0.08、0.10、0.20μg/mL,阿魏酸储备液稀释成浓度为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00μg/mL,按照上述色谱条件进行HPLC测定。噪音值(S/N)=3时的浓度是检测限,噪音值(S/N)=10时的浓度为测定限。

1.2.8 精密度和稳定性实验 分别精确吸取储备液,将川芎嗪储备液稀释成浓度为30.0μg/mL,阿魏酸储备液稀释成浓度为3.0μg/mL,连续进样5次,按照上述色谱条件进行HPLC测定,用相对标准偏差RSD表示精密度。

稳定性包括日内稳定性和日间稳定性,在日内(间隔4h)、日间(间隔1d)检测混合标准液(川芎嗪30μg/mL;阿魏酸3μg/mL)中各物质的质量浓度,按照上述色谱条件进行HPLC测定,分析实际检测到的质量浓度,用相对标准偏差RSD表示稳定性。

1.2.9 样品的测定和回收率实验 根据以上样品的处理条件及检测方法对食醋样品进行处理和检测;回收率是以实际检测样品添加标准品后回收来进行考察,精确量取食醋5mL置于100mL具塞三角瓶中,分别向三角瓶中加入适量川芎嗪和阿魏酸储备液,川芎嗪的加标水平为20、30、40、50、60μg/mL,阿魏酸的加标水平为6.0、8.0、10.0、12.0、14.0μg/mL,每个水平设3个重复,按上述样品处理方法制备样品,根据以上检测方法测定川芎嗪和阿魏酸的质量浓度。

回收率(%)=(Cn-Co)/W×100

式中：Cn-添加标准样品后样品中检测的质量浓度(μg/mL);Co-未添加标准品中样品的检测的质量浓度(μg/mL);W-标准品的添加量(μg/mL)。

2 结果与分析

2.1 川芎嗪和阿魏酸的同步提取

通过比较20、40、60℃下超声同步提取川芎嗪和阿魏酸,发现在40℃时两种物质回收率最高,且曾有报道称[23-24],川芎嗪和阿魏酸在高温下极易损失,应尽量避免高温,而提取溶剂乙醇在高温下挥发性极强,综上所述采用40℃提取为宜;阿魏酸存在顺反式结构,反式结构在一定时间内会转化为顺式结构,且得到本实验证实,所以样品要在短时间内进行处理;将食醋样品碱化可以使样品中的其它酸类形成盐类,且阿魏酸和川芎嗪在碱性条件下更稳定,有利于提取,在该体系下通过超声作用于样品使阿魏酸和川芎嗪更易溶解在溶剂中,提高了目标物质的提取率,为之后的色谱分离提供条件。

2.2 检测波长的确定

波长的扫描结果见图1。由于流动相甲醇在200nm的紫外吸收信号较强,会产生严重的基线干扰,且从光谱图中看出,川芎嗪和阿魏酸的最大吸收波长分别为296nm和320nm,兼顾两者,选择310nm作为检测波长。

图1 川芎嗪和阿魏酸对照品吸收光谱Fig.1 UV spectrum of tetramethylpyrazine and ferulic acid standard

2.3 流动相的选择

分析四种流动相甲醇∶水、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.1%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸)对阿魏酸和川芎嗪分离的影响,结果表明甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)和甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸),洗脱峰型良好且基线平稳,优于其它流动相,但考虑到较高浓度的冰乙酸会对色谱系统造成一定的损害,故选择甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)作为流动相。通过对比不同甲醇-冰乙酸水溶液分配比(20%、23%、26%,v/v)下的色谱图(图2～图4),得出分配比为23%时色谱图分离性较好,且出峰时间适宜,避开了样品中杂质峰的影响,因此选择甲醇-冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)的分配比23%。

图2 20%分配比下标准品与样品的HPLC色谱图Fig.2 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 20% distribution ratio注:A-川芎嗪;B-阿魏酸;C-食醋样品;D-食醋样品中添加混合标准品的样品;E-川芎嗪和阿魏酸的混合标准品，图3、图4同。

图3 23%分配比下标准品与样品的HPLC色谱图Fig.3 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 23% distribution ratio

图4 26%分配比下标准品与样品的HPLC色谱图Fig.4 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 26% distribution ratio

2.4 标准曲线

由检测结果得出,川芎嗪在1.00～60.00μg/mL范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=11623X-19495(R2=0.990),阿魏酸在1.00～15.00μg/mL范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=49162 X+2192(R2=0.997),根据标准品的质量浓度与峰面积之间的关系对样品中川芎嗪和阿魏酸进行定量。

2.5 检出限和测定限

根据测定不同质量浓度的川芎嗪和阿魏酸标准品溶液的检测结果,得出川芎嗪和阿魏酸的检出限分别为0.115、0.041μg/mL,测定限分别为0.383、0.135μg/mL。

2.6 精密度和稳定性

精密度的实验结果见表1,川芎嗪相对标准偏差(RSD)为1.31%,阿魏酸相对标准偏差(RSD)为1.15%,方法精密度高[25-26]。

表1 川芎嗪和阿魏酸精密度Table1 Precision of Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

稳定性实验结果由表2、表3得出,该方法在检测川芎嗪时日内精密度RSD值为1.84%,日间精密度RSD的2.46%,阿魏酸的日内稳定性RSD的值为1.57%,日间稳定性RSD值为2.87%,稳定性符合要求。

表2 川芎嗪和阿魏酸日内稳定性Table2 Results of inter-day stability testfor Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

表3 川芎嗪和阿魏酸日间稳定性Table3 Results of Intra-day stability testfor Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

2.7 样品测定和回收率

按上述处理方法和色谱条件对样品(特级保宁醋)中川芎嗪和阿魏酸含量进行测定,结果得出,样品中川芎嗪质量浓度为51.52μg/mL,阿魏酸质量浓度为11.54μg/mL,图5为食醋样品和对照品溶液的色谱图,从图5中可以看出川芎嗪的出峰时间为14.71min,阿魏酸的出峰时间为19.45min,由此可对阿魏酸和川芎嗪进行定性。

图5 食醋样品和标准品的HPLC色谱图Fig.5 The chromatogram of vinegar sample and standard sample 注:F-甲醇;G-川芎嗪和阿魏酸的混合标准品;H-食醋样品;I-川芎嗪标准品;J-阿魏酸标准品。

样品的回收率实验结果如表4所示,其中川芎嗪的回收率为95.17%～106.08%,平均回收率达到100.01%,RSD为1.03%～3.01%,阿魏酸的回收率为96.25%～104.82%,平均回收率达到99.85%,RSD为0.93%～3.05%,回收率实验结果在误差范围内,表明样品的前处理方法符合要求[11,25]。

3 结论

3.1 本文采用乙醇溶剂体系辅助超声提取食醋样品中的川芎嗪和阿魏酸,并碱化处理食醋样品使杂质形成盐类,有效去除了杂质;因阿魏酸为酸性化合物,易电离,在流动相中加入少量酸改善其峰形,且川芎嗪在酸性环境中的分离效果较好,故选择甲醇和冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)为流动相,且甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v)时目标峰的峰型分离较好。

表4 不同加标水平下的回收率实验结果Table4 Results of recovery test for spiked samples

3.2 本文建立高效液相色谱法同时检测食醋中川芎嗪和阿魏酸的方法,其检测条件为:采用Sepax GP-C18柱,流动相:甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v),检测波长310nm,柱温35℃,进样量10μL,1.0mL/min等梯度洗脱。由检测方法的评价结果得出川芎嗪在1.0～60.0μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系,回归方程为Y=11623X+19495(R2=0.990);阿魏酸在1.0～15.0μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系,回归方程为Y=49162X+2192(R2=0.997),且川芎嗪和阿魏酸的检出限分别为0.115、0.041μg/mL,测定限分别为0.383、0.135μg/mL,日内、日间稳定性较好,表明检测方法准确、可行;对其进行加标回收实验的结果得出川芎嗪的平均回收率达到100.01%,阿魏酸的平均回收率99.85%,表明样品的前处理方法符合要求。该方法操作简便快捷,重复性、稳定性好,结果可靠准确。本方法与LC/MS和GC/MS分析方法相比需要的仪器设备简单、检测成本低、对操作人员要求不高,可作为食醋质量控制标准检测的参考。

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Simultaneous determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar by HPLC

LI Jian-long1,LIU Shu-liang1,*,PENG Yang1,LIU Jun2,YANG Yong3,HAN Xin-feng1,HOU Xiao-yan1,XIA Xiao-long1,LUO Pei-wen1,JIA Qiu-si1

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.Colledge of Biology Engineering Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;3.Sichuan Baoning Vinegar Co.,Ltd.,Langzhong 645000,China)

This paper established a method for simultaneous determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar by HPLC. The analysis was performed on a Sepax GP-C18column with 35℃;the mobile phase was methanol-water(containing 0.2 % acetic acid)(23∶77,v/v);the detection wave length was 310nm;injection volume 10μL;the flow rate of gradient elution was 1.0mL/min. Results showed that good linearity was obtained over the range of 1.0 to 60.0μg/mL(R2=0.990)for tetramethylpyrazine and 1.0 to 15.0μg/mL(R2=0.997). The retention time of tetramethylpyrazine and Ferulic acid was 14.71 and 19.45min respectively,the average recovery was 100.01% and 99.85% respectively. This method was rapid,sensitive and the sample preparation was simple,so it could be applied to the determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar products.

HPLC;ferulic acid;tetramethylpyrazine;vinegar

2014-08-07

李建龙(1987-)，男，硕士研究生，研究方向：食品微生物。

*通讯作者:刘书亮(1968-)，男，博士，教授，主要从事食品微生物与发酵工程研究。

四川省科技厅科技支撑计划(2013NZ0055)。

TS207.3

A

:1002-0306(2015)09-0287-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.054