犬细小病毒PCR 检测方法的建立

黄雪梅 广西北海市海城区涠洲镇渔牧兽医站 536004

犬细小病毒（CPV）是在1978年首次发现，随后在全世界范围内流行，因此有关该病毒的研究工作开展得较晚。

为了进一步解决CPV 在临床上的快速诊断问题,针对VP2 基因设计特异引物[2]，预扩增片段大小990 bp，并通过条件优化试验确定合适退火温度、引物浓度、合适Mg2+浓度等，建立一个特异性好、敏感度高、快速简便检测CPV 核酸的PCR 方法。

1 实验材料与设备

疑似犬细小病毒病的犬粪便、犬细小病毒CPV、犬流感病毒CIV、犬瘟热病毒CDV，以及犬副流感病毒CPIV、缓冲液、Taq DNA 聚合酶、dNTPs(each 10 mmol/L)、dNTPs(each 2.5mmol/L)、DL2000 DNA Marker 、实验仪器等。

2 实验方法

（1）引物合成。根据GenBank 中登录的犬细小病毒序列[DQ903936],针对其VP2 基因,设计引物:CPV上游引物5-GTTCTGGGGGTGTGGGGATTT-3；下游引物5-CTCCCCCCCGTCCTGCTGCAA-3，预扩增片段大小990bp。用ddH2O 将引物稀释为20μmol/L，-20℃保存备用。

（2）目的基因产物的PCR 扩增。将以上成分混匀后，在UNO-II 型核酸扩增仪运行。运行程序如下。

表1 在25μ 的PCR 扩增体系中加入如下成分

（3）PCR 产物电泳检测。取PCR 产物5μL 加入Loading Buffer 1μL 混匀，加到1%琼脂糖凝胶的点样孔中，并设置分子量参照标准DNA Marker DL2000。先用100V 电压，50mA 电流进行电泳，待PCR 产物进入凝胶后，再以80V 电压，40mA 电流继续电泳，直到PCR 产物进入凝胶一定距离后（约30min），再进行凝胶成像拍照分析。

（4）特异性实验。根据建立的犬细小病毒PCR 检测方法，抽提犬流感病毒RNA、犬瘟热病毒DNA，以及犬副流感病毒RNA，并进行反转录制备模板加入到犬瘟热病毒RT-PCR 反应体系中进行扩增，同时设阳性对照，对PCR 产物进行电泳，检测该方法的特异性。

（5）敏感性实验。抽提病毒DNA，运用核酸蛋白测定仪进行DNA 含量测定，定量的DNA 依10 倍梯度依次进行稀释，将稀释后的DNA 进行PCR 反应，对PCR 产物进行电泳，检测该方法的敏感性。

（6）临床样品检测。对疑似犬细小病毒病的15例犬粪便进行临床检测。

3 结果

（1）特异性实验结果。分别以犬瘟热病毒（CDV）、犬流感病毒（CIV）、犬细小病毒(CPV)和犬副流感病毒(CPIV)作为样品，同时设立阴性对照作PCR 特异性检测，结果以CPV 阳性样品为模板的泳道出现明显的大小约为990bp 的扩增产物，其他样品呈阴性。结果表明，引物对CPV 具有专一性，可区分与犬细小病毒症状相似的一些疾病。

（2）敏感性检测结果。运用建立的犬细小病毒PCR 方法对犬细小病毒进行敏感性检测。结果该引物对犬细小病毒DNA 的最低检出量达到10pg，表明该检测方法对病毒目的基因扩真具有很高的敏感性。

（3）临床样品检测。在15 例疑似犬细小病毒的临床病料检测中，能够检测出特异性病毒的结果显示，有13 例出现大小约为990bp 扩增片段，阳性检出率约为86.66%。

通过针对VP2 基因设计特异引物,成功建立了特异性好、敏感度高、快速简便检测CPV 核酸的PCR方法。

94℃3min，1 个循环。94℃1 min，55℃1 min，72℃90s；30 个循环。72℃8min，1 个循环。

在PCR 扩增程序运行时，设立不加模板的阴性对照。反应结束后，取3μL PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)进行电泳检测。

[1]刘忠华,钟翎,贺星亮,等.用PCR 技术鉴定犬细小病毒弱毒疫苗株[J].中国兽医学报,2003,23(5):444-446.

[2]杨德威,宋延华,刘福安.应用套式PCR 在MDCK 细胞系中发现犬细小病毒[J].华南农业大学学报,2000,21(3):81-82.