红丝线草对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1表达的影响

网络出版时间：2015-01-13　网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1755.001.html

李志超， 黄俊敏， 李红莉

(唐山市玉田县中医医院， 河北 玉田　064100)



红丝线草对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1表达的影响

网络出版时间：2015-01-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1755.001.html

李志超， 黄俊敏， 李红莉

(唐山市玉田县中医医院， 河北 玉田064100)

[摘要]目的： 观察中药红丝线草对肝纤维化大鼠肝组织中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白表达的影响。方法： 将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组、红丝线草高、中、低剂量组共6组，每组10只；除正常组外，其余各组大鼠用二甲基亚硝胺(DMN)制作肝纤维化模型；正常组和模型组大鼠用等体积生理盐水喂养，秋水仙碱组、红丝线草高、中、低剂量组分别给予秋水仙碱0.1 mg/kg和高、中、低剂量红丝线草喂养各组大鼠，4周后处死，取大鼠肝脏，采用免疫组织化学方法检测各组大鼠肝组织中MMP-1及TIMP-1蛋白的表达。结果： 模型组MMP-1表达明显低于正常组(t=2.57，P<0.05)，TIMP-1表达明显高于正常组(t=7.26，P<0.05)；与模型组比较，红丝线草高、中剂量组大鼠肝组织中MMP-1蛋白表达明显升高(t=2.77和2.68，P<0.05)，TIMP-1蛋白表达明显降低(t=2.76和3.63，P<0.05)；红丝线草低剂量组MMP-1及TIMP-1蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义(t=1.16和1.41，P>0.05)；红丝线草高、中剂量组肝组织中MMP-1及TIMP-1蛋白表达与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义(t=1.29、2.68、0.05、0.16，P>0.05)。结论： 红丝线草抗肝纤维化机制可能与MMP-1及 TIMP-1表达水平有关。

[关键词]肝纤维化； 免疫组织化学； 基质金属蛋白酶； 基质金属蛋白酶抑制剂； 红丝线草

肝纤维化是肝细胞外基质降解减少，合成增加，导致纤维结缔组织增生，甚至形成假小叶。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-s，MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitor of matrix metalloproteinase-s,TIMPs)已被证实在肝纤维化中发挥重要作用，是调节肝细胞外基质降解与合成的重要因子。目前，肝纤维化的治疗尚无特效药。近年研究显示，中医药在肝纤维化的治疗方面具有很大优势[1]。红丝线草属爵床科红丝线草属植物，具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗病毒的作用，红丝线草内的多糖等有效成分还具有保肝、护肝、防治肝纤维化的作用[2-4]。因此，本研究通过观察红丝线草对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1蛋白表达的影响，探讨红丝线草防治肝纤维化的机制。

1材料与方法

1.1动物与试剂

SPF级雄性SD大鼠60只购自北京实验动物中心， 红丝线草乙醇总提取物由玉田县中医院药剂科提供，MMP-1，TIMP-1多克隆抗体，兔 SPkit 及DAB均购自武汉博士德有限公，秋水仙碱粉剂购自serva公司，二甲基亚硝胺(DMN，纯度99%)购自天津市化学试剂研究所。

1.2方法及动物模型

大鼠随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组、红丝线草高剂量组、红丝线草中剂量组、红丝线草低剂量组，共6组，每组10只。模型组、秋水仙碱组及红丝线草3个剂量组大鼠制作肝纤维化模型：造模周期为4周，腹腔注射0.5% 二甲基亚硝胺(2 mL/kg DMN)，每天1次，连续 3 d，停药 4 d，第1周用常规剂量的2/3。药物干预：秋水仙碱组剂量为0.1 mg/kg，红丝线草高剂量组为300 mg/kg、中剂量组200 mg/kg、低剂量组100 mg/kg ，灌胃给药, 每天1次；正常组和模型组用等体积生理盐水代替。6组大鼠均采用普通饮食饲养，自由饮水。4周后处死大鼠，肝脏常规取材，10%甲醛固定，脱水、包埋、切片, 免疫组织化学染色(EnVision法)。用已知阳性片作阳性对照, PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3观察指标

结果判定：MMP-1及TIMP-1均以胞质或胞膜中出现棕黄色、棕褐色颗粒为阳性细胞；按染色强度打分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；按阳性细胞所占百分比打分：0分为阴性，1分为<10%，2分为11%~50%，3分为51%~75%，4分为>75%。将染色强度分数与阳性细胞所占百分比分数相加，计算每张切片的表达分值。

1.4统计学方法

2结果

除正常组外，各组大鼠在实验中均有死亡。模型组MMP-1蛋白表达明显低于正常组(t=2.57，P<0.05)，TIMP-1蛋白表达明显高于正常组(t=7.26，P<0.05)；与模型组比较，红丝线草高、中剂量组大鼠肝组织中MMP-1蛋白表达明显升高(t=2.77和2.68，P<0.05)，TIMP-1蛋白表达明显降低(t=2.76和3.63，P<0.05)；红丝线草低剂量组MMP-1及TIMP-1蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义(t=1.16和1.41，P>0.05)；红丝线草高、中剂量组肝组织中MMP-1及TIMP-1蛋白表达与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义(t=1.29、2.68、0.05、0.16，P>0.05)。见表1、图1和图2。

表1　各组大鼠肝脏组织中MMP-1和TIMP-1表达

(1)与正常组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05

注：A为正常组，B为秋水仙碱组，C为模型组，D、E、F分别为红丝线草高、中、低剂量组图1　各组大鼠肝组织中MMP-1表达(EnVision，×100)Fig.1　The expression of MMP-1 in liver tissue of rats in each group

注：A为正常组，B为秋水仙碱组，C为模型组，D、E、F分别为红丝线草高、中、低剂量组图2　各组大鼠肝组织中TIMP-1的表达(EnVision，×100)Fig.2　The expression of TIMP-1 in liver tissue of rats in each group

3讨论

肝纤维化是肝炎、饮酒、高脂等不良刺激的代偿反应，具有可逆性，其机制为细胞外基质的生成与降解失衡，引起细胞外基质积累，甚至肝硬化。肝细胞外基质降解受到MMP和TIMPS调节，MMPS促进肝细胞外基质的降解，TIMPS可通过抑制MMPS的表达，从而使肝细胞外基质降解减少。MMP-1和TIMP-1被公认在调节细胞外基质方面发挥关键作用，能够准确反应肝细胞外基质的降解与合成情况。研究表明，肝纤维化时，MMP-1活性抑制，TIMP-1表达增加，使肝细胞外基质降解减少，促进肝纤维化的发展[5-6]。研究表明，红丝线草提取物具有保肝、护肝的作用，还有降糖、降脂、降酶，减少脂肪在肝细胞内的沉积，防止脂肪肝形成的作用[2，7]。本实验前期研究证实，红丝线草能够降低DMN诱导的肝纤维化大鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、透明质酸及层粘连蛋白水平，HE切片观察红丝线草干预的肝纤维化大鼠肝组织的炎症程度和纤维化程度明显好于模型组，作用机制与降低TGF-β1蛋白表达有关。秋水仙碱是治疗肝纤维化的有效药物，因此，本实验增加秋水仙碱组，作为阳性药物组与其它各组比较。本实验采用免疫组织化学方法，通过观察各组大鼠肝组织MMP-1、TIMP-1蛋白的表达，探讨红丝线草对肝细胞外基质的降解与合成的影响。本研究结果显示，模型组大鼠MMP-1蛋白表达明显低于正常组，TIMP-1蛋白表达明显高于正常组，证实MMP-1及TIMP-1蛋白在肝纤维化的发生发展中的确发挥着一定作用；与模型组比较，红丝线草高、中剂量组大鼠肝组织中MMP-1蛋白表达明显升高，TIMP-1蛋白表达明显降低，提示红丝线草可能通过降低TIMP-1，提高MMP-1表达，促进肝细胞外基质的降解，减少肝细胞外基质的合成，防止肝细胞外基质过度沉积，从而起到防治肝纤维化的作用。

参考文献4

[1] 廖昭名,江峰,叶永安,等.抗纤抑癌方对肝纤维化大鼠肝组织基质金属蛋白酶表达的影响[J].中医药临床杂志, 2009(1): 63-65.

[2] 皮慧芳，杨希雄，阮汉利，等.红丝线草保肝护肝活性部位的筛选[J].中国医院药学杂志， 2007(2)：172-173.

[3] 黄俊敏，李志超. 红丝线草对大鼠肝纤维化的作用研究[J].四川中医， 2012(12)：54-56.

[4] 黄俊敏，李志超，李红利，等.红丝线草对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1及VEGF蛋白表达的影响[J].标记免疫分析与临床， 2013(2)：96-99.

[5] 郑伟达,王小众.基质金属蛋白酶及其抑制物与实验性肝纤维化[J].世界华人消化杂志, 2004(2):428-430.

[6] Eatall R,Brenner DA.Liver fibrosis [J].J Clin investing, 2005(2):209-219.

[7] 刘月丽，吕俊华.红丝线草提取物对胰岛素抵抗性脂肪肝大鼠肝脏保护作用的研究[J].中国中药杂志， 2007(10)：940-942.

(2014-10-01收稿，2014-12-29修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 刘华

Effect ofPeristrophejaponicaon the Expression of MMP-1 and

TIMP-1 in Hepatic Tissue of Hepatic Fibrosis Rats

LI Zhichao, HUANG Junmin，LI Hongli

(YutianHospitalofTraditionalChineseMedicine,Yutian064100,Hebei,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Peristrophe japonica on the expression of MMP-1and TIMP-1 in hepatic fibrosis rats induced by Dimethylnitrosamine (DMN). Methods: Sixty SD rats were divided randomly into six groups: normal control group, model group, positive control group (colchicin group), and Peristrophe japonica treated groups including high (group H), middle (group M) and low (group L) doses, with 10 rats in each group. Except normal control group, the other groups were induced to construct hepatic fibrosis model with 0.5% dimethyl nitrosamine (DMN). After model was constructed, positive control group was fed with 0.1 mg/kg colchicin; group H, group M and group L were fed with high, middle and low doses of Peristrophe japonica respectively, while normal control group and model group were fed with equal volume of saline. The rats in all groups were executed 4 weeks later, and the expression levels of MMP-1, TIMP-1 in liver tissue of rats were measured by immunohistochemistry. Results: In model group, the expression level of MMP-1 protein was obviously lower than that of normal control group (P<0.05), and the expression level of TIMP-1 protein was obviously higher than that of normal control group (P<0.05). Compared with those of model group, MMP-1 protein expression levels in groups H and M were significantly higher(t=2.77 and 2.68，P<0.05), and the TIMP-1 protein expression levels were significantly lower (t=2.76 and 3.63，P<0.05). In group L, the expression levels of the 2 proteins were not obviously different from those of model group (t=1.16 and 1.41，P>0.05). The expression levels of the 2 proteins in groups H and M did not differ significantly from that in group colchicin. Conclusion: The anti hepatic fibrosis mechanism of Peristrophe japonica may relate to the expression of MMP-1 and TIMP-1.

[Key words]hepatic fibrosis; immunohistochemistry; matrix metalloproteinase-1; tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1; peristrophejaponica

[中图分类号]R361.3; R286.5; R575

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)01-0052-04