电针对创伤后应激障碍模型大鼠蓝斑nNOS表达的影响**



电针对创伤后应激障碍模型大鼠蓝斑nNOS表达的影响**

谢康楠1唐国庆1詹海斌1杨凯1赵健2

皖南医学院1临床医学院2011级2人体解剖学教研室，安徽省芜湖市241002

创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder, PTSD)，指对亲身经历、目击的导致或可能导致自己、他人死亡或严重躯体伤害的意外事件、严重创伤的强烈反应，主要由交感肾上腺髓质系统(SAS)的快速激活和下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA axis)的兴奋激活来激发。一氧化氮(Nitricoxide, NO)在生物体各组织中都有广泛的分布，特别是在神经组织中。研究表明针灸有助于治疗PTSD患者[1，2]，迈克尔·霍利菲尔德博士及其同事对73位被诊断为PTSD患者进行分组治疗，结果发现中医传统的针灸治疗效果与认知行为治疗相似[3]。国内学者采用穴位刺激调控结合药物[4]、不同针灸方法结合[5]、认知行为疗法配合穴位刺激调控法[6，7]及药物治疗配合高频重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)[8]等方法治疗PTSD患者，均取得了肯定的临床疗效。上述研究多集中在电针对PTSD的临床疗效方面，而电针对PTSD治疗的机制研究报道较少。本实验主要观察低频电针对PTSD模型大鼠蓝斑内神经元型一氧化氮合酶(neural nitric oxide synthase,nNOS)表达的影响，探讨电针治疗PTSD的可能机制，旨在为临床应用电针治疗PTSD提供一些基础形态学依据。

1材料与方法

1.1动物分组与模型建立成年雄性SD大鼠30只，体重200~250g。动物适应性饲养1周后随即分为三组：正常对照组、模型组和电针组。模型组采用单程长时应激(Single prolonged stress,SPS)方法，步骤如下：禁锢2h；强迫性游水20min后干燥毛发，休息15min；乙醚麻醉。无干扰空间、常规喂养1周后对大鼠进行行为学检测(旷场实验、拒俘反射、恐惧记忆)，以确定模型成功。电针组在模型建立后给予低频(2Hz)电针刺激“百会”与“足三里”穴，强度3V，波宽1ms，持续30min，连续1周。对照组不予以任何刺激和电针治疗。

1.2实验方法上述实验步骤完成后，三组大鼠给予戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉，经左心室灌注固定，取脑放置于4℃的4%甲醛固定，脱水、透明、浸蜡、包埋。连续组织切片，片厚5μm，常规脱蜡至水，SABC法进行免疫组化染色：3%H2O2孵育5~10min，微波抗原修复(高温3min，低温12min)，自然冷却后滴加5%BSA封闭液室温孵育20min，滴加一抗4℃过夜。次日于常温滴加生物素化二抗37℃水浴2h，滴加SABC 37℃水浴30min，DAB显色，镜下控制显色时间。最后脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗。

1.3统计学分析利用Olympus显微镜及成像系统图像分析系统对各组大鼠蓝斑(图1)nNOS阳性神经元进行计数并测量平均灰度值，每组10只大鼠共测20个单位面积的灰度值(其中每只随机测2个单位面积)。数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析，组间比较用LSD检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

图1　大鼠蓝斑区定位

注：免疫组化染色，×40，冠状切面前面观，黑色方框内为镜下检测部位。

2结果

2.1行为学结果观察模型组大鼠5min穿行格数和直立次数显著低于正常对照组(P<0.01)，电针组大鼠5min穿行格数和直立次数较模型组有所增加(P<0.01)，但仍低于正常对照组。见表1。

表1　各组大鼠行为学观察结果(±s，n=10)

表1　各组大鼠行为学观察结果(±s，n=10)

行为正常对照组模型组电针组穿格数97.4±11.3950.9±7.59*72.6±14.95#直立数14.4±2.559.7±2.26*14.1±3.03#

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

2.2免疫组织化学实验结果观察正常对照组大鼠蓝斑区有少量nNOS阳性神经元表达，胞浆着色，胞核呈空泡状。模型组大鼠蓝斑nNOS阳性神经元数量较正常对照组明显增多(P<0.01)，细胞染色加深，细胞平均灰度值明显降低(P<0.01)。电针组大鼠蓝斑区nNOS阳性神经元数较模型组明显减少，细胞染色变淡，平均灰度值有所升高(P<0.01)。 见图2、3。

正常对照组　　　　　　　　　　　　　　　　模型组　　　　　　　　　　　　　　　电针组

3讨论

以往的研究表明，通过单一应激因子制作PTSD动物模型往往很难产生理想的效应。由Porsolt[9]等最先设计了强迫游泳，用来模拟自然情况下在水中的创伤经历，大鼠会产生溺水的恐怖感，从发生上接近PTSD的致病病因。随后Liberzon[10]等进一步改进发展了单一长时程应激，增加心理应激(束缚)、生理应激(强迫游泳20min后，再以乙醚麻醉致意识丧失)，模拟了大鼠在自然环境中有可能遭遇到的应激类型，再给予大鼠应激后采用不受打扰的饲养方式，这样较好的避免了环境因素对模型的影响，确保模型的稳定性，并能诱发动物表现出PTSD的临床症状和神经内分泌改变[11]，随后在2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议上，SPS法被确定为公认的PTSD动物模型制作方法[12]。本实验进一步验证了SPS法能使大鼠在相对较短时间内的应激下理想地显示长期的行为学改变。SPS刺激后的大鼠经过7~14d静养，在活动习性上有明显改变，焦虑情绪以及恐惧记忆增强，学习能力受损，与PTSD患者临床症状需要几个月的孕育期，其症状开始明朗的特点相似，其表现符合PTSD患者主要的临床表现。

图3　各组大鼠蓝斑区nNOS阳性神经元细胞数

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

根据NOS的性质结构及其对钙的依赖性不同，可分为二大类，即Ca2+依赖性的结构型NOS和非Ca2+依赖性的诱导型NOS，前者又根据存在的部位和分子的大小不同分为nNOS和内皮型NOS，在中枢神经系统中主要是nNOS。nNOS在神经内分泌调节与行为调控、突触可塑性与神经再生、神经传导与神经元发育等多种中枢神经系统生理功能中起重要的调节作用[13]。侯良芹[14]等研究发现，PTSD模型大鼠海马nNOS表达增强，电针可恢复性下调其表达。PTSD模型大鼠海马内高表达的NO可能参与了海马神经元损伤、凋亡导致体积缩小的病理过程。

蓝斑位于脑桥背侧第四脑室底的界沟上部深面，纤维联系较为广泛，其内富含大量的去甲肾上腺(NE)能神经元，并在应激状态下被迅速激活，使NE合成增多，从而适应机体内外环境的变化。李慢[15]对发生PTSD的退伍军人进行尸体解剖发现，蓝斑神经元数目减少，并存在神经元细胞凋亡现象。由此可见蓝斑的功能变化在PTSD的发生中有重要作用。本实验观察到PTSD模型大鼠蓝斑内nNOS的表达增强，这与海马区的现象一致，进一步提示NO在应激引起的神经元损伤、凋亡等病理过程中起着重要的调节作用。

百会位居巅顶，归属督脉，督脉“入络脑”，本着“经脉所过，主治所及”，其对于与脑有关的神经系统疾病有治疗作用。朱寅初等[16]研究显示，电针百会、足三里穴对模型动物记忆力的下降有改善作用。所以，选取督脉腧穴是治疗精神神经疾病的重要方法。本实验结果显示，电针组大鼠蓝斑内nNOS表达较模型组有所减弱，提示电针能下调PTSD模型大鼠nNOS的过高表达，其机制可能与电针能显著降低应激大鼠异常升高的蓝斑NO含量和NOS活性，从而防止蓝斑神经细胞丢失有关，确切机理尚有待进一步研究。

参考文献

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[11]Yamamoto S,Morinobu S,Fuchikami M,etal. Effects of single prolonged stress and D-cycloserine on contextual fear extinction and hippocampal NMDA receptor expression in a rat model of PTSD〔J〕.Neuropsychopharmacology,2008,33(9):2108-2116.

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[16]朱寅初,徐国亭.电针百会、足三里穴对拟血管性痴呆大鼠记忆影响〔J〕.针灸临床杂志,2003,19(7):61.

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摘要目的：观察电针对创伤后应激障碍(PTSD)模型大鼠行为学的影响，并进一步研究电针对PTSD模型大鼠蓝斑核神经元型一氧化氮合酶(nNOS)表达的影响。方法：将雄性SD大鼠30只随机分为三组：正常对照组、模型组和电针组，每组10只。采用单程长时应激(SPS)方法建立PTSD模型，模型建立后电针大鼠“百会”穴和“足三里”穴，频率2Hz，强度3V，持续30min，连续1周。采用免疫组织化学方法观察nNOS在大鼠蓝斑的表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠蓝斑nNOS阳性细胞数明显增加(P<0.01)，平均灰度值显著降低(P<0.01)；电针后大鼠蓝斑nNOS阳性细胞数明显减少(P<0.01)，平均灰度值显著增加(P<0.01)。 结论：电针可下调PTSD模型大鼠蓝斑nNOS的表达，推测这可能是电针治疗PTSD机制之一。

关键词PTSD蓝斑神经元型一氧化氮合酶电针大鼠

Effect of Electroacupuncture on Locus nNOS Expression in Rats of Post-traumatic Stress Disorder Model

XIE Kangnan#，TANG Guoqing，ZHAN Haibin，etal.#DepartmentofClinicalMedicine,Classof2011,WannanMedicalCollege,WuhuCity,AnhuiProvince241002

ABSTRACTObjective:To observe the electrical behavior of rats to learn the impact of post-traumatic stress disorder(PTSD),and further study the expression for the electric rat model of PTSD locus coeruleus neuronal nitric oxide synthase (nNOS) impact.Methods:30 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: normal control group, model group and electroacupuncture(EA) groups of 10. Using one-way long stress (SPS) method to establish PTSD model after model“Baihui”Point EA rats and“Zusanli”Point, frequency 2Hz,strength 3V,sustained 30min,for a week.Immunohistochemistry was used to observe the expression of nNOS in rat locus coeruleus.Results:Compared with the normal control group,model group locus coeruleus nNOS positive cells was significantly increased (P<0.01),significantly reduce the average gray value(P<0.01);rat locus coeruleus nNOS positive cells was significantly reduced after EA (P<0.01),a significant increase in the mean gray value (P<0.01).Conclusion:EA can down regulate the expression of nNOS locus coeruleus PTSD rat model,suggesting that this may be one mechanism of acupuncture treatment of PTSD.

KEY WORDSPTSD,Locus coeruleus,Neuronal nitric oxide synthase,EA,Rat

收稿日期2015-05-15

中图分类号：R-33

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)18-2421-03

基金项目：安徽省大学生创新训练项目(AH201310368127)。通讯作者：赵健