三七皂苷R1对D-半乳糖诱导痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响及抗氧化应激作用研究Δ

黄金兰，秦嫦云，周 楠，高 山，杜 伟，谢艳秋，王 霞，施 倩，吴登攀（徐州医学院药学院，江苏徐州 221004）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年性痴呆，好发于老年人。在众多的AD 发病机制学说中，氧化应激学说越来越受到学术界的重视，从氧化应激角度研发的防治AD 的新药可延缓AD 病程的发展，对AD 的早期治疗具有非常重要的意义。氧化应激是指氧化物超过了机体内源性的抗氧化能力从而引起分子氧化，产生高度活性的羟自由基及单个氧原子等活性氧类（ROS）。正常生理条件下，人体具备一个完整的抗氧化防御系统，如酶类抗氧化系统。所以机体的氧化水平与抗氧化水平在各种因素的参与下保持着动态平衡。当机体受到有害刺激时，ROS产生过多，氧化程度超出氧化物的清除能力，则可直接引起蛋白质、脂质和DNA等胞内大分子的氧化，损害细胞的基本结构，最终导致细胞死亡。研究发现，基本上所有的胞内大分子（蛋白质、DNA、脂质等）在AD患者的脑组织中都可以发现有氧化形式的存在，且氧化应激在AD患者发病早期就已经出现[1]。

目前，已发现的碱基氧化产物超过30种，其中鸟嘌呤氧化生成的8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）是最重要的变异源性物质，被公认为是DNA 氧化损伤的标志物[2]。研究发现，三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，NGR1）可通过提高抗氧化物酶的活性，从而减轻氧化应激引起的神经元损伤[3-4]；还可通过提高神经元突触可塑性而提高AD 模型小鼠学习记忆功能[5]。然而NGR1是否可以通过减轻氧化应激而改善AD小鼠学习记忆能力尚未见相关文献报道。笔者拟以NGR1为研究对象，通过建立D-半乳糖诱导的氧化应激痴呆小鼠模型（即AD小鼠模型），探讨NGR1对该模型小鼠学习记忆能力的影响，并通过检测小鼠血清和脑组织中抗氧化酶系活性及脑组织内氧化产物的含量，初步阐明NGR1影响AD模型小鼠学习记忆能力的机制，为研发防治AD的新药提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

ACT-200 型水迷宫跟踪分析系统（美国Coulbourn 公司）；722N 型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；Elx808 型酶标仪（美国BioTek 公司）；5804R 型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 药品与试剂

NGR1（南京广润生物制品有限公司，批号：GR-133-140324，纯度：≥98.0%）；吡拉西坦片（广东华南制药有限公司，批号：110102，规格：每片0.4 g）；D-半乳糖（上海源叶生物科技有限公司，批号：YY11147）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成科技有限公司，批号：A001-1、A005、A007-1）：小鼠8-OHdG酶联免疫分析试剂盒（徐州微科曼得生物工程有限公司，批号：V02165M）。

1.3 动物

2 方法

2.1 分组、造模及给药

将50 只昆明小鼠随机均分为正常组、模型组、阳性对照（吡拉西坦，150 mg/kg）组和NGR1低、高剂量（12.5、25 mg/kg）组（剂量根据预实验结果设置），除正常组每日颈背部ih 等容生理盐水外，其余各组每日颈背部ih 10%D-半乳糖（0.01 ml/g）以复制氧化应激引起的AD 小鼠模型，qd；并于造模同时ig 相应药物，正常组和模型组ig蒸馏水，qd，连续4周。

2.2 小鼠记忆行为能力测定

给药结束后，采用Morris 水迷宫试验检测小鼠的记忆行为能力。水迷宫为直径150 cm、高50 cm 的圆形水池，水深约32 cm，其中放置一个直径为17 cm、高30 cm的圆形平台，水温保持（25±2）℃。将小鼠面向池壁由4个入水点放入池中，记录其90 s 内成功进驻平台（小鼠找到平台并在平台上滞留5 s为成功进驻）所需时间。如在90 s内不能成功进驻平台，则将其引上平台并令其停留10 s。每只鼠每天训练4次，两次训练时间间隔为30～40 min，共训练4 d。获得性训练结束后，撤除平台，将小鼠由原先平台象限对侧放入水中，记录其在原平台所在象限游泳的时间占总游泳时间的百分比，即原平台象限游泳时间百分比。

2.3 小鼠血清及大脑组织样品的制备

实验动物行为学检测后，对小鼠眼球取血并盛于离心管中，静置30 min，待血液凝固后以离心半径为8 cm（下同）、3 000 r/min 离心10 min，吸取上清（即血清）备用。再于冰台上迅速剥离小鼠大脑组织，预冷生理盐水漂洗，滤纸吸干多余水分后称质量，按质量-体积比1 ∶9加入预冷生理盐水，玻璃匀浆器制成10%的脑匀浆液，于高速冷冻离心机中以14 000 r/min离心10 min，取上清，并用二辛可酸（BCA）法检测蛋白浓度。

2.4 指标检测

采用可见分光光度法测定小鼠血清及脑组织中T-SOD、GSH-PX、CAT活性，具体操作按T-SOD、GSH-PX、CAT试剂盒说明书进行，并按试剂盒说明书中公式计算相应酶活力。采用酶联免疫吸附法测定小鼠脑组织中8-OHdG含量，具体步骤及含量计算方法参见8-OHdG酶联免疫分析试剂盒说明书。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 NGR1对模型小鼠学习记忆能力的影响

与正常组比较，模型组小鼠的原平台象限游泳时间百分比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组小鼠的原平台象限游泳时间百分比明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.01），结果见表1。

表1 各组小鼠的原平台象限游泳时间百分比测定结果（，n＝10）Tab 1 The results of the percentage of swimming time in original platform quadrant of mice in each group（，n＝10）

表1 各组小鼠的原平台象限游泳时间百分比测定结果（，n＝10）Tab 1 The results of the percentage of swimming time in original platform quadrant of mice in each group（，n＝10）

注：与正常组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

3.2 NGR1对模型小鼠血清及脑组织中T-SOD、GSH-PX 和CAT活性的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清和脑组织中T-SOD、GSH-PX、CAT 的活性均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，NGR1低、高剂量组及阳性对照组血清和脑组织中T-SOD、GSH-PX、CAT的活性均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），结果见表2。

表2 各组小鼠血清及脑组织中T-SOD、GSH-PX和CAT活性检测结果（，n＝10）Tab 2 The results of activities of T-SOD，GSH-PX and CAT in serum and cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

表2 各组小鼠血清及脑组织中T-SOD、GSH-PX和CAT活性检测结果（，n＝10）Tab 2 The results of activities of T-SOD，GSH-PX and CAT in serum and cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

注：与正常组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.3 NGR1对模型小鼠脑组织中8-OHdG含量的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠脑组织中8-OHdG含量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，NGR1低、高剂量组及阳性对照组小鼠脑组织中8-OHdG含量降低，差异有统计学意义（P＜0.01），结果见表3。

表3 各组小鼠脑组织中8-OHdG 含量测定结果（，n＝10）Tab 3 The results of content determination of 8-OHdG in cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

表3 各组小鼠脑组织中8-OHdG 含量测定结果（，n＝10）Tab 3 The results of content determination of 8-OHdG in cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

注：与正常组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

4 讨论

D-半乳糖诱导的氧化应激AD模型是通过D-半乳糖诱导机体产生自由基、脂质过氧化等氧化应激反应，从而导致学习与记忆能力衰退的痴呆模型[6]。其造模周期短、衰老变化明显、稳定性好，是目前国际上较为公认的痴呆模型。本实验建立D-半乳糖诱导AD小鼠模型，并在行为学、氧化与抗氧化应激方面对其进行评价。结果发现，与正常组比较，模型组小鼠的原平台象限游泳时间百分比及血清和脑组织中T-SOD、GSH-PX 和CAT 的活性均明显降低（P＜0.01），而脑组织中DNA 的氧化产物8-OHdG 含量则明显升高（P＜0.01），此结果与文献[7]报道一致，提示模型小鼠出现明显衰老体征、记忆能力下降、抗氧化酶活力下降，D-半乳糖诱导的AD 模型是成功的。

文献报道三七总皂苷（PNS）可通过降低AD 模型大鼠脑内氧化应激水平从而改善大鼠的学习记忆功能[8]，而作为PNS的主要单体成分之一的NGR1可通过提高抗氧化物酶的活性，从而减轻氧化应激引起的神经元损伤[1-2]。吡拉西坦是一种经典的脑代谢活化剂，其能够增加脑血流量，促进代谢，增强脑部左右两半球间神经信息的传递，具有较强的抗脑缺氧作用，可保护外源性伤害性刺激对大脑的损害，改善学习和记忆等功效[9]，故本实验以其为阳性对照药物。研究结果显示，与模型组比较，给药组小鼠的原平台象限游泳时间百分比明显延长（P＜0.01），提示NGR1可改善D-半乳糖诱导的AD模型小鼠的学习记忆能力；生化检测结果显示药物处理组的小鼠血清和脑组织中T-SOD、GSH-PX 和CAT 的活性均高于模型组（P＜0.05 或P＜0.01），而脑组织中DNA 的氧化产物8-OHdG含量则明显降低（P＜0.01），提示NGR1可提高氧化应激AD模型小鼠血清及脑组织中SOD、GSH和CAT的活性，并可显著降低脑组织中DNA的氧化产物8-OHdG的水平。

综上所述，NGR1可通过减轻氧化应激从而改善AD 模型小鼠的学习记忆能力，是有潜力的AD治疗药物。

[1]Galasko D，Montine TJ.Biomarkers of oxidative damage and inflammation in Alzheimer’s disease[J].Biomark Med，2010，4（1）：27.

[2]高玉楠，杨靖，宋沁馨，等.8-羟基脱氧鸟苷作为DNA 氧化损伤标志物在疾病诊断中的应用[J].药物与临床研究，2012，2（3）：223.

[3]Meng X，Wang M，Wang X，et al.Suppression of NADPH oxidase and mitochondrion-derived superoxide by notoginsenoside R1protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through estrogen receptor-dependent activation of Akt/Nrf2 pathways[J].Free Radic Res，2014，48（7）：823.

[4]Meng X，Sun G，Ye J，et al.Notoginsenoside R1-mediated neuroprotection involves estrogen receptor-dependent crosstalk between Akt and ERK1/2 pathways：a novel mechanism of Nrf2/ARE signaling activation[J].Free Radic Res，2014，48（4）：445.

[5]Yan S，Li Z，Li H，et al.Notoginsenoside R1increases neuronal excitability and ameliorates synaptic and memory dysfunction following amyloid elevation[J].Sci Rep，2014，doi：10.1038/srep06352.

[6]初晓，姚如泳，韩志武，等.茶多酚对D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的调节作用[J].中国医院药学杂志，2006，26（5）：635.

[7]秦红兵，杨朝晔，范忆江，等.D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的建立与评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（7）：1 275.

[8]屈泽强，谢智光，王乃平，等.三七总皂苷抗衰老作用的实验研究[J].广州中医药大学学报，2005，22（2）：130.

[9]谢展雄，吴建伟，吴铁松，等.吡拉西坦对D-半乳糖致衰老模型大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影响[J].中国药房，2009，20（19）：1 459.