基于核酸侵入反应的基因突变检测方法研究进展

邹秉杰，周国华, 2*，宋沁馨（. 南京军区南京总医院药理科，江苏 南京20002；2. 中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京20009；3. 中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京20009）



基于核酸侵入反应的基因突变检测方法研究进展

邹秉杰1，周国华1, 2*，宋沁馨2, 3**
（1. 南京军区南京总医院药理科，江苏 南京210002；2. 中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京210009；3. 中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京210009）

[摘要]肿瘤靶向药物治疗需要检测特异性的基因突变。尽管已开发出多种基于模板扩增的基因突变检测方法，但由于存在扩增产物交叉污染的风险，其应用受到极大限制。基于信号扩增的核酸侵入反应，由于不存在扩增产物污染的风险，并且具有良好的单碱基识别特异性，非常适用于基因突变的检测。因此，一系列基于核酸侵入反应的基因突变检测方法应运而生。综述若干基于核酸侵入反应的基因突变检测方法原理与应用研究。

[关键词]核酸侵入反应；基因突变；信号扩增；荧光检测；可视化检测

接受日期：2015-10-15

项目资助：国家自然科学基金（No. 31200638, 21275161, 21475151, 31300704）；江苏省基础研究计划（自然科学基金）项目（No. BK20151445）；中国博士后科学基金（No. 2012M512179, 2013T60962）；中央高校基本科研业务费重点项目（No. 2015ZD008）；江苏高校优势学科建设工程资助项目；江苏省青蓝工程项目

研究方向：药物基因组学，分子诊断新技术；

Tel：025-80860195；E-mail：ghzhou@nju.edu.cn

**通讯作者：宋沁馨，副教授，博士生导师；

研究方向：临床药物分析，分子诊断新技术；

Tel：025-80860196；E-mail：songqinxin@cpu.edu.cn

Research Progress on Invasive Reaction-based Gene Mutation Detection Methods

ZOU Bingjie1, ZHOU Guohua1, 2, SONG Qinxin2, 3
(1. Department of Pharmacology, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Nanjing 210002, China; 2. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance of Ministry of Education, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 3. Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

[Abstract] The detection of drug-sensitive gene mutations is required especially in tumor-targeted therapies. Although a number of template amplification-based gene mutation detection methods have been developed, the increased risk of cross-contamination from amplicons limits their applications. In contrast, signal amplification-based invasive reaction, with no risk of contamination from amplicons and a high specificity of singlebase discrimination, is more suitable for mutation detection. Therefore, many invasive reaction-based gene mutation detection methods have been developed. The principles and applications of several invasive reaction-based gene mutation detection methods were reviewed.

[Key words] invasive reaction; gene mutation; signal amplification; fluorescence detection; colorimetric detection

体细胞基因突变（somatic mutation）是肿瘤个体化治疗中一种重要的生物标识。许多肿瘤靶向性药物的疗效与肿瘤细胞是否发生特异性基因突变相关，例如，酪氨酸激酶抑制剂仅对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因19、20和21外显子发生突变的肿瘤细胞有明显抑制作用，利用此类药物如吉非替尼和厄洛替尼进行肿瘤治疗时，需要对肿瘤细胞中EGFR基因的相关突变位点进行检测[1-2]；KRAS基因中的某些位点发生突变会导致肿瘤细胞对抗EGFR单克隆抗体药物耐药，在利用抗EGFR单克隆抗体药物如帕尼单抗（panitumumab）和西妥昔单抗（cetuximab）进行肿瘤治疗时，需要对肿瘤细胞中KRAS基因相关突变位点进行检测[3]。

通常，肿瘤组织样本中含有大量正常细胞，其中发生基因突变的肿瘤细胞数量较少，因此提取到的核酸样本中基因突变体的相对丰度很低，而其中所含大量的野生型模板会严重干扰突变模板的检测。在对样本进行基因突变体检测时，要求所采用的检测方法具有很高的灵敏度与特异性，能够从大量的野生型模板中扩增出微量的突变模板。目前，临床用于基因突变检测的方法主要包括PCR产物测序法[4-5]、等位基因特异性PCR法[6-7]（又见：Whitcombe等, Nat Biotechnol, 1999年）、高分辨熔解曲线（high-resolution melting, HRM）法[8-9]等。然而，这些方法均基于模板扩增，容易造成扩增产物的交叉污染，并且其检测特异性与敏感性难以实现对极低丰度基因突变进行检测。

核酸侵入反应是由一类特殊的核酸内切酶催化的反应，这类酶可特异性识别核酸3’末端侵入下游双链所产生的侵入结构，并能切割被侵入的下游双链核酸5’翘起片段（flap）。该反应在DNA复制中冈崎片段引物的切除以及DNA修复过程中起着重要作用。催化核酸侵入反应的酶主要包括flap内切酶Ⅰ（flap endonuclease 1, FEN 1）家族中的一些成员，如AfuFEN 1、PfuFEN 1、MjaFEN 1、MthFEN 1等，以及经人工突变而丧失聚合活性的一些古细菌来源的DNA聚合酶，如TaqPol、TthPol、TaqExo等（Kaiser等, J Biol Chem, 1999年）。研究发现，其中一些酶，如AfuFEN 1、TthPol等，具有良好的结构识别特异性，它们仅对上游寡核苷酸片段3’端侵入下游双链区域1个碱基的侵入结构进行特异性识别并切割[10]。利用此类酶的这一特性，人们开发出可对单碱基基因突变进行高特异性检测的若干基于核酸侵入反应的检测技术，这些技术均基于信号扩增，且其扩增产物交叉污染的风险很低，适合在临床推广应用。本文对基于核酸侵入反应的基因突变检测技术进行综述。

1　级联核酸侵入技术

级联核酸侵入技术（Invader assay）是将两步核酸侵入反应通过探针设计进行偶联，进一步增加了核酸检测的灵敏度[11-12]（又见：Lyamichev等, Nat Biotechnol, 1999年）。该技术利用核酸侵入反应的高特异性结构识别性能与探针杂交的特异性，可对单碱基突变[13]、基因拷贝数变化[14]等基因突变类型进行检测。目前，已成功开发出基于该技术的各类核酸检测试剂盒，并应用于临床。

1.1检测原理

级联核酸侵入反应的原理如图1所示[15]。首先，针对待测核酸模板，设计一对上下游探针，使这对探针与模板杂交后，形成上游探针3’端一个碱基侵入到下游探针与模板杂交双链中的侵入结构，FEN 酶识别这种侵入结构，并将下游探针5’区域与模板不互补的flap片段连同被侵入的碱基切割下来。在设计上下游探针时，将上游探针的熔解温度（Tm）设定在较反应温度高5~6 ℃，而下游探针的Tm值接近反应温度。这样，在反应过程中，上游探针会牢固地与模板杂交形成双链，而下游探针在被切割后会与模板解离，新的完整的下游探针会再次与模板杂交形成侵入结构，引发再一次的切割；经过一定的反应时间，形成flap片段的积累，由此完成了对待测模板的第1次信号放大，将待测模板转化为具有特异性核酸序列的flap寡核苷酸片段（信号分子）。

在反应体系中，还存在与flap信号分子对应的发夹状荧光报告探针，该探针5’端标记有荧光报告分子与荧光淬灭基团，3’区域可与前一步核酸侵入反应切割产生的flap片段杂交，再次形成核酸侵入结构，FEN酶识别该结构，并将发夹探针上带有荧光基团的碱基切割下来，使其与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。由于flap片段的Tm值设计为接近反应温度，因此每条flap片段可动态地与很多发夹探针进行杂交形成侵入结构，从而产生逐渐增强的荧光信号，将模板特异性来源的信号进一步放大。在进行单碱基突变模板检测时，可将突变碱基设计在核酸侵入结构中被侵入的碱基处，突变型探针在与野生型模板杂交时，由于侵入位置处的碱基不匹配而不能形成侵入结构，不产生flap切割，无荧光信号产生；而当体系中存在突变模板时，核酸侵入结构可以形成，将产生对应的荧光信号。而且，通过设计不同的flap片段及对应不同发射波长的荧光报告发夹探针，还可同时对野生型模板或多个突变模板进行检测。

图1　级联核酸侵入技术原理Figure 1 The principle of Invader assay

1.2 应用研究

利用级联核酸侵入技术，能够对人基因组DNA不经扩增而直接检测单碱基多态性（SNP）位点。有人利用该技术测定了与深度静脉栓塞相关的V因子上G1691A突变，在反应体系中加入70 ng人基因组DNA，即可检测出对应的基因型。而且，与基于PCR扩增的限制性酶切片段多态性（PCR-RFLP）及等位基因特异性PCR（AS-PCR）方法进行对比的结果表明，该技术对372例样本的检测结果中仅有2例结果不一致，检测结果一致率达到99.5%[16]。另有学者利用级联核酸侵入技术开发出高通量的SNP检测平台，其可自动化进行试剂的准备，对1 500个样本的20个SNP检测结果表明，该方法的准确性达到99.7%，非常适合对大样本的平行检测[17]。

此外，利用级联核酸侵入反应，还可对RNA进行定量检测，与检测DNA不同之处在于所用到的FEN酶能识别RNA模板，并且该酶由于不能有效利用flap片段的动态杂交进行信号放大，体系中的发夹探针也被替换为两条单链杂交成的双链探针，其中带有荧光与淬灭基团标记探针的Tm值接近反应温度，可进行动态杂交退火切割，产生信号的放大，而flap片段的Tm值高于反应温度，与第2步反应的模板杂交后不发生解离，这样造成了多余的下游探针也会牢固地结合到第2步反应的模板上，与flap片段竞争造成信号的抑制。为了克服这一问题，将两步核酸侵入反应分步进行，首先进行第1步核酸侵入反应产生flap片段，然后再加入一条可与下游探针结合的捕获探针将多余的下游探针捕获，不与flap片段竞争结合第2步反应的模板，然后再加入第2步反应的模板与荧光标记探针进行第2步核酸侵入反应，从而放大信号（见图2）[18-20]。

尽管级联核酸侵入技术具有较高的检测灵敏度，可不经过模板扩增而直接检测，但对于待测模板含量过低的样本也会出现检不出的情况。因此，有人将PCR与级联核酸侵入技术偶联，建立了检测灵敏度更高的Invader Plus技术[21-24]。该技术通过设计Tm值高于核酸侵入下游探针的扩增引物，采用高于下游探针Tm值的退火延伸温度进行PCR扩增，扩增结束后，再将反应温度降低到下游探针Tm值附近，进行核酸侵入信号扩增反应，并进行终点荧光信号的测定，或者在PCR扩增循环中，降低温度到下游探针Tm值附近，进行核酸侵入信号扩增反应，从而实现对扩增产物的实时定量检测。Zou等[25]利用实时定量Invader Plus技术，成功对粪便DNA中大肠癌特异性基因甲基化位点进行了检测，结果表明，该方法可检测到低至10拷贝的甲基化DNA模板，并且可从大量的非甲基化模板背景中检测出仅含有0.01%的甲基化模板。他们利用该方法检测了91例粪便DNA样本中BMP3、NDRG4、VIM和TFPI2的甲基化水平，以对大肠癌进行诊断，结果，通过对粪便样本中这4个基因的检测而对大肠癌进行诊断的灵敏度分别为84%、92%、86%和92%，而对腺瘤进行诊断的灵敏度分别为68%、76%、76%和88%，诊断特异性达到95%，提示该方法可用于临床上大肠癌的早期诊断。此外，通过优化实时定量Invader Plus的反应条件，还可实现对单碱基突变位点的检测。

图2　级联核酸侵入技术检测RNA的原理Figure 2　The principle of Invader assay for detecting RNA template

目前，级联核酸侵入技术大多应用于SNP或病原体核酸的分型，较少应用于体细胞突变的测定。由于在级联核酸侵入技术应用中，下游检测探针与发夹探针退火杂交产生的背景信号以及下游探针与非匹配模板之间产生的非特异性信号常会干扰单碱基突变位点的测定，因此，还需要通过优化反应条件、改善检测原理等途径来进一步提高该技术的检测特异性，从而实现对体细胞突变的高灵敏、高特异检测。

2　核酸侵入反应偶联切刻内切酶信号扩增法

切刻内切酶信号扩增是近年发展起来的新的核酸信号扩增技术，其通过切刻内切酶（nicking endonuclase）识别DNA双链特异序列、但只切割其中一条链而形成一个切口的特性，能够使检测信号放大1 000倍[26-30]。但是，切刻内切酶信号扩增技术的应用需要待测模板具有切刻内切酶识别位点，并且1 000倍的放大倍数不能满足常规核酸检测的要求。核酸侵入反应对待测靶标无序列要求，仅需设计能形成侵入结构的上下游探针，即可实现待测模板转化并扩增为flap信号分子，而将产生的flap分子作为切刻内切酶信号扩增的模板，既能增大信号扩增的放大倍数，又能通过通用的flap片段解决切刻内切酶信号扩增需要模板具有切刻内切酶识别位点的不足。由此，人们建立了核酸侵入反应偶联切刻内切酶信号扩增检测方法。

2.1检测原理

利用核酸侵入反应偶联切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法其原理如图3所示[31]，即依次包括以下步骤：

（1）核酸侵入信号扩增阶段，设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸模板杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，形成侵入结构，下游探针有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的Tm在催化核酸侵入反应的FEN酶切反应温度±1 ℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的Tm要较 FEN酶切反应温度高5~10 ℃；靶核酸与上下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入FEN，FEN识别探针-靶核酸特异性的侵入结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第1个碱基切下，因为侵入反应温度接近下游探针与模板配对部分的Tm，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针Tm高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被FEN切割，形成flap片段的积累。

图3　级联酶促信号扩增法原理Figure 3 The principle of cascade enzymatic signal amplification

（2）flap连接阶段，向步骤（1）的反应产物中加入连接酶体系及环状部分杂交有一段5’磷酸化的寡核苷酸的分子信标（molecular beacon），在T4连接酶的作用下，步骤（1）核酸侵入信号扩增产生的flap片段会与分子信标环状部分的寡核苷酸片段相连，将分子信标打开发出荧光信号，同时连接好的flap片段与分子信标杂交成的双链上形成了完整的切刻内切酶识别位点，得到含有切刻内切酶识别位点的连接产物。

（3）切刻内切酶信号扩增阶段,将切刻内切酶反应体系加入到步骤（2）得到的连接产物中，切刻内切酶反应体系中的切刻内切酶识别分子信标与连接好的flap片段杂交形成的切刻内切酶位点，并只切割分子信标链，切割后的分子信标两部分片段与未切割的完整的分子信标相比，Tm低，在切刻内切酶酶切反应温度下会与连接的flap片段分离，使分子信标的荧光基团与淬灭基团分离，新的完整的分子信标会再次与连接的flap片段杂交，形成新一轮的切刻内切酶切割循环，这一过程使荧光信号逐渐增强，从而将信号进一步扩增，利用实时荧光检测设备可以对产生的荧光信号进行监测。该方法是一种3个酶促反应相级联的信号扩增方法，可称其为“级联酶促信号扩增法（cascade enzymatic signal amplification, CESA）”。

2.2应用研究

CESA法由于偶联了两步信号放大，使得待测模板的信号放大倍数达到107以上，检测灵敏度能达到1 fmol·L-1。此外，CESA法具有较高的特异性，可区分检测仅含有单个碱基差异的模板，当突变碱基位于侵入位点时，该方法能够从野生模板中检测出仅含有0.1%的突变模板，并可实现对非小细胞肺癌石蜡包埋组织（FFPE）中的基因突变进行检测[31]。

CESA法中，由于切割产生的flap片段基本与待测核酸序列无关，在整个检测过程中，只有步骤（1）中的上下游探针需要针对不同模板设计，其他各步骤中的探针均可通用，并且上下游探针不需要任何修饰，合成价格便宜。信号发生分子为已经发展成熟并广泛应用的分子信标，相对于其他信号扩增的信号分子更加稳定、廉价。由于FEN仅识别上下游探针形成的特异结构，对模板序列没有要求，所以本方法可以检测任意模板，而无序列限制。检测过程是在同一管中加入各阶段试剂，操作简便，使得自动化和规模化成为可能。然而，CESA法步骤较多，荧光标记探针的使用增加了检测仪器设备的成本，需进一步简化操作，改变信号检测方法，以提高CESA法的实用性。

3　核酸侵入反应偶联纳米金探针可视化检测法

核酸纳米金探针是将寡核苷酸片段修饰在纳米金表面而形成的纳米颗粒，表面的寡核苷酸片段可与待测靶核酸进行特异性杂交，使纳米金颗粒发生聚集，从而导致纳米粒子光散射性质发生改变，造成肉眼可见的颜色变化[32]（又见：Mirkin等, Nature, 1996年；Storhoff等, J Am Chem Soc, 1998年）。利用纳米金探针能实现对核酸的可视化检测，从而避免使用荧光检测装置，降低仪器设备成本[33]。然而，纳米金探针杂交聚集直接检测靶核酸的灵敏度较低，一般需要偶联其他扩增方法才能真正用于生物样本的检测。将核酸侵入反应与纳米金探针可视化检测相偶联，既能弥补纳米金探针检测法灵敏度低的不足，又能利用纳米金探针可视化检测的优点，从而降低核酸侵入反应需荧光检测设备而造成的设备高成本，同时，由于核酸侵入反应具有高特异性，可实现对基因突变的可视化检测。

3.1检测原理

核酸侵入反应偶联纳米金探针可视化检测法的原理与CESA法类似，是将分子信标荧光探针变换为一条两端分别能与两种纳米金探针杂交的桥连分子，从而利用纳米金探针聚集与解离产生的颜色变化来实现可视化检测（见图4）[34]。首先针对待测模板设计一条上游探针与下游探针，使其与模板退火后形成侵入结构，FEN酶识别该结构将flap片段切割下来，完整的下游探针会再次与模板退火，形成切割循环，产生积累的flap片段；紧接着加入含有桥连分子的连接反应体系，flap片段将与桥连分子上的一段5’磷酸化的寡核酸片段相连，形成切刻内切酶的底物，在加入切刻内切酶后，触发另一切割循环，不断将桥连分子切断，从而使纳米金探针无法聚集保持红色；当体系中不含待测模板时或模板与上下游探针不能完全匹配形成侵入结构时，无法触发核酸侵入反应，不能产生flap片段，进而无法引发切刻内切酶反应，从而使体系中的桥连分子保持完整，加入纳米金探针后，桥连分子与其杂交，造成纳米金探针聚集而显示紫色，通过肉眼观察就能判断是否存在待测模板。

3.2应用研究

核酸侵入反应偶联纳米金可视化方法可检测低至1 pmol·L-1的待测模板，并具有检测含单个突变碱基模板的能力。对不同突变比例的模拟样本检测结果表明，该方法能检测在野生模板混有的1%突变模板，具有较好的检测特异性。对非小细胞肺癌FFPE样本中的EGFR 858T>G突变检测结果表明，该方法能准确检测到组织中是否含有基因突变，可应用于临床实际样本的检测[34]。该方法克服了传统切刻内切酶信号扩增需要待测模板含有切刻内切酶位点的限制，并解决了基于纳米金探针可视化检测方法中探针不通用的问题。通过肉眼直接观测，能从大量野生型模板中检测出仅有1%的突变型模板，可以对实际样本中的基因突变进行检测，在临床靶向药物治疗前基因突变检测中具有很大的应用前景。然而，该方法检测过程包括核酸侵入反应、连接反应、切刻内切酶反应和纳米金探针杂交反应等4个步骤，较为繁琐，不利于推广应用，有待改进。

图4　核酸侵入反应偶联纳米金探针可视化检测法原理Figure 4　The principle of colorimetric detection by invasive reaction combined with gold nanoparticle probes assembling

4　核酸侵入反应偶联延伸链置换信号扩增法

尽管偶联切刻内切酶信号扩增法可显著提高核酸侵入反应的检测灵敏度，但不论是基于分子信标的荧光检测还是基于纳米金探针的可视化检测，均需要繁琐的检测步骤，不利于推广应用。虽然级联核酸侵入反应体系简单，易于操作，但下游探针造成的背景信号及需要特殊修饰的荧光发夹探针，限制了其在基因突变检测中的应用。因此，开发出操作步骤简单、成本低、特异性好的信号扩增突变检测方法，十分重要。核酸侵入反应偶联延伸链置换信号扩增法是将核酸侵入反应与延伸链置换信号扩增技术相结合，利用延伸链置换进一步放大flap信号，所涉及的反应仅为核酸侵入反应与延伸链置换反应，体系简单，易于操作，同时具有较高的检测特异性，具有一定的应用前景。

4.1检测原理

核酸侵入反应偶联延伸链置换信号扩增法的检测原理如图5所示[35]。首先，针对待测突变模板设计上游探针和下游探针，突变位点位于侵入位点处，进行核酸侵入反应，产生flap片段。然后，将反应产物加入到延伸链置换信号扩增体系中，该体系含有环状部分序列与flap片段互补的分子信标，在聚合酶和dCTP、dGTP、dTTP存在下，flap片段沿分子信标环状序列延伸，由于体系中不含有三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP），当遇到分子信标茎部的T碱基时，延伸停止；延伸后分子信标将被打开，产生荧光信号，同时暴露出单链的茎部序列；此时，体系中存在的一条可与分子信标茎部序列退火的引物，将会沿分子信标延伸，置换下延伸的flap片段，使其可与另一分子信标杂交，打开分子信标茎部，继续产生延伸置换反应，不断产生荧光信号，从而通过荧光信号的有无来判断待测突变靶标存在与否。

该方法的关键在于在分子信标上设计一个阻断延伸的碱基。当体系中仅有3种与阻隔碱基不匹配的三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）时，flap片段的延伸会停止在阻隔碱基处，使延伸的flap片段3’端不会与体系中的引物退火延伸，否则被置换出的延伸flap片段将被引物延伸成双链，无法与新的分子信标退火，造成信号扩增受阻，降低检测的灵敏度。

图5　核酸侵入反应偶联延伸链置换信号扩增法原理Figure 5 The principle of invasive reaction combined with strand displacement signal amplification

4.2应用研究

核酸侵入反应偶联延伸链置换信号扩增法的检测特异性取决于核酸侵入反应的特异性，当上下游探针与模板杂交区域存在单个碱基突变时，会使检测信号下降，当突变碱基越接近侵入位点，检测特异性越高。因此，在进行单碱基基因突变位点检测时，可设计上下游探针将突变位点处于侵入碱基处，实现对突变模板的高特异性检测。研究表明，该方法可实现对非小细胞肺癌FFPE样本中EGFR基因突变位点 858T>G的检测[35]；而且，链置换延伸信号扩增反应体系简单，仅需一条延伸引物、一条分子信标及DNA聚合酶，即可实现对待测模板的检测[36-38]。不过，仅链置换延伸反应的信号放大倍数有限，检测特异性不高，检测通用性差，而将链置换延伸反应与核酸侵入反应偶联，利用核酸侵入反应产生的flap片段引发链置换延伸反应，既增加了链置换反应的信号放大倍数，又使延伸置换反应体系通用性提高，同时，利用核酸侵入反应的高特异性，可实现对单个碱基突变的待测靶标进行检测。尽管链置换延伸反应偶联核酸侵入反应，使检测灵敏度有较大提高，但依然难以满足对微量核酸样本的检测，需要进一步设法提高检测灵敏度，以满足临床检测要求。

5　结语

核酸侵入反应是一种能将待测模板转化为flap信号分子的信号扩增反应，由于其不对待测模板进行扩增，因此不会产生扩增产物的交叉污染，非常适用于临床核酸检测。此外，核酸侵入反应具有很高的特异性，仅当检测探针与模板形成单碱基侵入的三链结构时才能引发反应，因此，可实现对单碱基基因突变的高特异检测。

然而，仅进行一步核酸侵入反应的扩增倍数有限，往往需要与其他核酸信号扩增方法相偶联来进一步提高检测灵敏度。级联核酸侵入技术、核酸侵入反应偶联切刻内切酶信号扩增技术以及核酸侵入反应偶联延伸链置换信号扩增技术均可实现对待测靶标的高灵敏、高特异检测，并且均具有探针通用性好、检测成本低、反应条件温和等优点。但是，这些方法的信号扩增能力依然较为有限，最高仅能达到107倍，不能达到PCR的放大倍数（109倍），因此，难以用于检测极低含量的目标模板。所以，将核酸侵入反应与具有更高扩增能力的方法相结合，利用核酸侵入反应的结构识别高特异性，开发更高灵敏度、高特异的基因突变检测方法，依然是今后基因突变检测研究的主攻方向。可以相信，基于核酸侵入反应的基因突变检测方法将会成为临床个体化用药相关突变检测的有力工具。

[参 考 文 献]

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勘误

本刊2015年第10期789页图11因印刷工作失误，导致图上数据未显示，特此勘误，并向广大读者致歉。图11的完整表述如下所示：

图11　2020年研发投入前 10强药企Figure 11　Pharmaceutical R&D spend in 2020: top 10 companies

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*通讯作者：周国华，教授，博士生导师；

[中图分类号]R446.7

[文献标志码]A

[文章编号]1001-5094（2015）11-0846-09