西地那非对噪声性聋豚鼠耳蜗外毛细胞及听功能的影响

梁媛张淑君张勋

1承德医学院附属医院耳鼻咽喉科(承德　067000) ; 2　河北医科大学第三医院耳鼻咽喉科

西地那非对噪声性聋豚鼠耳蜗外毛细胞及听功能的影响

梁媛1张淑君1张勋2

1承德医学院附属医院耳鼻咽喉科(承德067000) ; 2河北医科大学第三医院耳鼻咽喉科

【摘要】目的探讨5-磷酸二酯酶(phosphodiesterasetype 5，PDE5)抑制剂西地那非对噪声性聋豚鼠耳蜗显微结构的影响。方法30只豚鼠随机分为对照组、噪声暴露组和PDE5抑制剂组，每组10只。PDE5抑制剂组和噪声暴露组豚鼠在110 dB SPL白噪声暴露2周后分别腹腔注射西地那非10 mg·kg-1·d-1及生理盐水4 ml·kg-1·d-1，连续给药4周;对照组安静环境饲养，不给予噪声暴露及任何药物。分别于噪声暴露前1天、噪声暴露后给药前及给药第1、2及4周各组行ABR检测，并通过光镜观察噪声暴露后4周豚鼠耳蜗外毛细胞缺失率变化。结果

与噪声暴露前相比，PDE5抑制剂组和噪声暴露组ABR反应阈明显升高，波I潜伏期明显延长，但PDE5抑制剂组的增幅均小于噪声暴露组，差异有统计学意义(P＜0.01)。正常对照组外毛细胞无明显缺失，噪声暴露组和PDE5抑制组外毛细胞缺失率分别为39.30%±5.69%和37.13%±7.81%，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论PDE5抑制剂不能促使坏死脱落的毛细胞再生，但能在一定程度上恢复噪声性听力损失豚鼠的听功能。

【关键词】西地那非;噪声性聋;毛细胞

网络出版时间:2015-9-10 16: 47

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20150910.1647.024.html

噪声性聋(noise-induced hearing loss，NIHL)是因长期接触噪声刺激所引起的缓慢进行性感音神经性聋，其机制尚未明了，主要归纳为机械学说、血管学说、代谢学说、钙离子紊乱学说、神经递质生物特性变化、一氧化氮(NO)/环磷酸鸟苷(cGMP)学说等［1］。许多扩血管药物因其能提高内耳血流量和改善血管痉挛而被用于噪声性听力损失的治疗，但噪声性聋目前仍缺乏真正有效的防治方法。

5-磷酸二酯酶(Phosphodiesterasetype5，PDE5)抑制剂通过增强NO/cGMP途径，升高cGMP水平，从而起到扩张血管平滑肌的作用。西地那非是选择性5-磷酸二酯酶抑制剂，到目前为止，已有许多研究探讨了PDE5抑制剂在性功能障碍、心血管系统、肺动脉、呼吸系统、镇痛及协同抗损失方面的治疗作用，但其对听损伤的作用尚无系统的报道。研究证实PDE5抑制剂能改善内皮祖细胞功能，在一定程度上增加内皮祖细胞数量［2］。Jaumamm等［3］首次在耳蜗中发现PDE5蛋白高表达，并与环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶-1(Prkg1)编码基因部分共定位。本研究旨在通过给予噪声性聋模型豚鼠应用西地那非，观察其听功能及耳蜗外毛细胞的变化，探讨PDE5抑制剂是否能减轻噪声对豚鼠耳蜗听功能的损伤，以期为噪声性聋的治疗提供参考。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器枸橼酸西地那非(美国辉瑞，批号: C070652)，Keyponit型4通道听觉脑干诱发电位仪(Dantec，丹麦)，解剖显微镜(Mnler显微镜，德国)，光学显微镜(OlympusBX-51，日本)。

1.2实验动物分组及记录电极安放选择耳廓反射灵敏的健康杂色雄性豚鼠30只(承德医学院实验动物中心提供)，体重250～305 g。随机分为正常对照组、噪声暴露组和PDE5抑制剂组，每组10只。各组豚鼠在经戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉及无菌条件下于颅顶部双侧皮层听区硬膜外手术埋植不锈钢丝慢性电极(记录电极)，牙科水泥固定，稳定1周后进行实验。

1.3噪声暴露方法噪声暴露组和PDE5抑制剂组豚鼠予噪声暴露2周。将豚鼠置于自制小笼内(20 cm×20 cm×20 cm)，每笼1只，放入暴露舱(26 m3)中;由信号发生器产生20～2000 Hz的白噪声，经GY型400W扩音器放大，由扬声器组向暴露舱播放;暴露时用B＆K 2107型频率分析仪连续监测，噪声声压级为110 dB A，声强波动范围±1 dB，每日暴露1次，每次1.5 h，连续暴露2周。对照组豚鼠安静环境中饲养，不给予噪声暴露。

1.4动物给药方法噪声暴露组和PDE5抑制剂组豚鼠噪声暴露结束后即开始给药，噪声暴露组腹腔注射生理盐水(4 ml/kg，每日1次)，PDE5抑制剂组豚鼠腹腔注射西地那非10 mg/kg(将西地那非用生理盐水稀释，4 ml/kg，每日1次)，连续给药4周，对照组不给药。

1.5听性脑干反应(ABR)测试动物保持清醒状态，半限制于测试笼中，置于隔声电屏蔽室内。分别于噪声暴露前1 d，噪声暴露2周后给药前及药物干预后第1、2、4周进行ABR测试(Dantec PA800) ;对照组在相同时间点测试，所有动物均测试右耳。测试时记录电极置于颅顶部，参考电极和接地电极分别置于同侧和对侧乳突部，滤波带通30～3 000 Hz，叠加1 024次，扫描时间15 ms;采用0.1 ms方波脉冲刺激声，频率20 Hz，以波Ⅲ刚出现时的刺激强度作为ABR阈值，同时记录80 dB nHL刺激强度下波Ⅰ潜伏期。

1.6耳蜗铺片光镜标本制作采用改良耳蜗铺片技术铺片: 3组动物均取其右耳耳蜗铺片作光镜观察。豚鼠完成最后一次给药及行ABR测试后断头处死，取出颞骨，在解剖显微镜下打开听泡，蜗尖钻孔及镫骨脱位，蜗内灌流10%福尔马林3～5次，并浸入10%福尔马林溶液中固定30 min，“摘帽”方式将附有基底膜的蜗轴连同颞骨组织块于10%福尔马林中固定1小时，Harris苏木精染色，分离基底膜。高倍视野下从基底膜起始端起顺次记数20个视野内外毛细胞数，计算外毛细胞缺失率。

1.7统计学方法应用SPSS15.0统计软件，ABR测试数据采用完全随机设计资料的方差分析，毛细胞缺失率采用多个样本率比较方法分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组豚鼠一般情况变化实验过程中，豚鼠无死亡、中耳感染、行走不稳等现象，给药后均未出现明显的药物不良反应。噪声暴露组动物进行相应处理后均逐渐出现饮食量下降，活动减少，体重下降(表1) ; PDE5抑制剂组动物用药四周后，其体重较噪声暴露组有显著性升高(P＜0.05)，但与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，余一般情况与正常对照组无明显差异。

2.2各组豚鼠ABR检测结果对照组豚鼠整个实验期间无明显听损伤，噪声暴露组和PDE5抑制

表1　三组豚鼠不同时间点的体重(g，珋x±s)

剂组豚鼠均有不同程度的听损伤，表现为ABR反应阈升高(表2)，其中噪声暴露组较为明显，噪声暴露组给药前及给药1、2、4周后ABR阈值较噪声暴露前升高，差异均有统计学意义(P＜0.05) ; PDE5抑制剂组给药前及给药1、2、4周后ABR阈值较噪声暴露前升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，其给药4周后ABR阈值较给药1、2周后降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。PDE5抑制剂组与噪声暴露组相比，除噪声暴露结束后给药前这一时间点以外，给药后各时间点ABR阈值差异均具有统计学意义(P＜0.05)。PDE5组腹腔注射西地那非后第1周至第4周，ABR阈值呈下降趋势，而噪声暴露组腹腔注射生理盐水后第1～4周ABR反应阈仍呈上升趋势，给药4周后与给药1周后相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

噪声暴露组和PDE5抑制剂组分别与对照组比较，ABR波Ⅰ潜伏期均有所延长，差异有统计学意义(P＜0.05) ; PDE5抑制剂组与噪声暴露组比较，除给药前外，给药1、2、4周后其波Ⅰ潜伏期均较噪声暴露组缩短(P＜0.05) (表3)。

表2　三组豚鼠不同时间点的ABR阈值(dB nHL，珋x±s)

表3　三组豚鼠不同时间点的ABR波Ⅰ潜伏期(ms，珋x±s)

2.3各组豚鼠耳蜗外毛细胞缺失率比较给药4周后，正常对照组外毛细胞无明显缺失(图1)，噪声暴露组外毛细胞缺失严重，缺失率为39.30%± 5.69%(图2)，PDE5抑制剂组外毛细胞缺失较噪声暴露组轻，缺失率为37.13%±7.81% (图3)，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)，但两组与正常组相比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

图1　正常组豚鼠耳蜗铺片毛细胞形态

图2　噪声暴露组豚鼠耳蜗铺片毛细胞形态

图3　PDE5抑制剂组豚鼠耳蜗铺片毛细胞形态

3　讨论

许多研究证实内耳中存在一氧化氮/环鸟苷酸(NO/cGMP)途径，且该途径对耳蜗的微循环和生理功能有调节作用，特别是在听觉传导、内环境稳定及微循环改善方面。Corti器中NO/cGMP通路的关键酶可溶性环磷酸鸟苷合酶、环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶-1(Prkg1)仅表达于支持细胞上［4］，而哺乳动物的支持细胞是潜在的神经递质、神经调质和神经体液因子的靶细胞，豚鼠柱状细胞的游离钙浓度是通过嘌呤和NO-cGMP-蛋白激酶G通路调节的［5］;支持细胞的位移可调控听觉灵敏度，当暴露于高强度噪声时，可保护耳蜗功能［4］。支持细胞间、支持细胞与外毛细胞间的缝隙连接，对小离子的交换和细胞生理的协调具有重要意义。耳蜗中的缝隙连接蛋白主要为Cx26和Cx30，存在于耳蜗内的支持细胞和连接组织细胞中，cGMP、三磷酸肌醇、ATP和cAMP等阴离子参与细胞间信号传递、营养、能量代谢是通过连接蛋白26实现的［6］，从而推测NO/cGMP通路通过调控支持细胞的功能状态，影响基底膜及盖膜的紧张度，间接影响外毛细胞的功能;或者通过支持细胞与外毛细胞间的缝隙连接调节外毛细胞内的Ca2+浓度，从而调节外毛细胞的灵敏度。此外，以分离的支持细胞作为研究对象的实验，证明了支持细胞内的游离钙调节也与NO-cGMP通路相关［7］。

PDE5抑制剂在临床上成功的应用，归结于PDEs能够终止环核苷酸信号肽的表达［8］。西地那非作为选择性5-磷酸二酯酶抑制剂，能够抑制cGMP降解，进一步影响NO的合成，从而起到扩张血管的作用;同时，通过增强磷酸化Akt和磷酸化ecNOS的表达，而使内皮型NO的释放增加，进而改善内皮细胞功能。强噪声可引起内耳血管收缩，血流量减少［9］。本研究结果显示噪声暴露组和PDE5抑制剂组豚鼠经稳态白噪声连续暴露后均有ABR阈值升高、波Ⅰ潜伏期延长，在噪声暴露后4周，噪声暴露组ABR平均反应阈仍然高达50 dB nHL以上，波Ⅰ平均潜伏期达1.98 ms，可认为该组动物有永久性ABR阈移;而PDE5抑制剂组豚鼠ABR阈移的幅度及波Ⅰ潜伏期延长的程度明显低于噪声暴露组，在给药4周后，其ABR阈值已基本接近噪声暴露前水平，波Ⅰ潜伏期也明显低于噪声暴露组。Jaumann等通过实验首次在耳蜗中发现PDE5蛋白高表达，并与Prkg1编码基因部位共定位，提出耳蜗毛细胞中存在PDE5-cGMP-Prkg1信号肽［3］。由此推测PDE5抑制剂可能是通过NO-cGMP-Prkg1途径对耳蜗微循环及生理功能进行调节，从而改善其听功能。

Chen［10］在以大鼠为对象，探讨耳蜗毛细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性与永久性阈移程度的相关性的实验中，发现单纯暴露于噪声条件下(100 dB)导致35 dB听力损伤的大鼠，相比较于100 dB白噪声及CO共同作用下导致高达50 dB听力损失的大鼠，其毛细胞缺失数无明显差异，故提出听阈上升与毛细胞缺失不相关;且听力图与耳蜗电位图在所有频率上也并不总能呈现良好的相关性［10，11］。本研究结果也显示PDE5抑制剂组动物听功能虽较噪声暴露组明显改善，但两组间耳蜗毛细胞缺失率并无明显的统计学差异。噪声暴露后，耳蜗毛细胞的损伤存在凋亡和坏死两种截然不同的死亡方式，但以凋亡为主［12］。细胞凋亡是有机体消除衰老的、异常的以及存在潜在危害的细胞的程序性细胞死亡，是一个主动的、耗能的过程。主要表现为细胞核固缩、核碎裂，而细胞膜保持完整。而坏死是一个被动的、不耗能的过程，主要表现为早期细胞肿胀、细胞膜破裂、胞浆释出。二者均引起不同程度的细胞功能损伤。本实验条件有限，耳蜗硬基底膜铺片HE染色并不能定量检测凋亡和坏死的毛细胞，也不能区分发展为毛细胞缺失的凋亡及坏死的毛细胞，只能观察到毛细胞存在和缺失两种状态。因此，毛细胞缺失率无差异并不意味毛细胞的凋亡率或毛细胞损伤程度相同，有可能在本实验中，PDE5抑制剂组外毛细胞凋亡率低于噪声组，但这需要进一步研究。

从本实验结果来看，腹腔注射PDE5抑制剂虽不能促使已在噪声性聋造模过程中坏死脱落的毛细胞再生，但是它能降低噪声性听觉损伤引起的ABR阈值升高，缩短其引起的波Ⅰ潜伏期延长。由此推测PDE5抑制剂可能使噪声所致听力损失有一定的逆转，希望能为噪声性聋的药物治疗提供一点启示和实验依据。但对于PDE5抑制剂如何顺利到达内耳微环境及不同剂量药物如何影响内耳等尚需通过实验进一步探讨。

4参考文献

1赖丹，黎万荣，李兴启.一氧化氮对过氧化氢所致听力损失的保护作用［J］.生理学报，2004，56: 237.

2 Wayman C，Hornby S，Burden A，et al.Sildenafil increases erection hardness by improved penile oxygenation in the anaesthetized dog ［J］.J Sex Med，2006，3(Suppl 3) : 226.

3 Jaumann M，Dettling J，Gubelt M，et al.cGMP-Prkg1 signaling and Pde5 inhibition shelter cochlear hair cells and hearing function ［J］.Nature Medicine，2012，18: 252.

4 Flock A，Flock B，Fridberger A，et al.Supporting cells contribute to control of hearing sensitivity［J］.J Neurosci，1999，19: 4498.

5 Chung JW，Schacht J.ATP and nitric oxide modulate intracellular calcium in isolated pillar cells of the guinea pig cochlea［J］.J Assoc Res Otolaryngo1，2001，2: 399.

6张璞，林曦，曲雁.Connexin蛋白与耳聋［J］.中华耳科学杂志，2013，11: 156.

7 Matsunobu T，Schacht J.Nitric oxide/cyclic GMP pathway attenuates ATP-evoked intracellular calcium increase in supporting cells of the guinea pig cochlea［J］.J Compar Neubio，2000，423: 452.

8 Lugnier C.Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) superfamily: a new target for the development of specific therapeutic agents ［J］.Pharmacol Ther，2006，109: 366.

9郑贵亮，翟所强.噪声性耳聋的发病机制研究进展［J］.山东医药，2008，48: 115.

10 Chen GD，Mcwilliams ML，Fechter LD.Succinate dehydrogenase (SDH) activity in hair cells: a correlate for permanent threshold elevations［J］.Hear Res，2000，145: 91.

11 Chen GD，Fechter LD.The relationship between noise-induced hearing loss and hair cell loss in rats［J］.Hear Res，2003，177: 81.

12杨卫平，胡博华.三种检测耳蜗毛细胞死亡模式方法的比较［J］.中华耳科学杂志，2004，2: 301.

(2015-03-16收稿)

(本文编辑周涛)

·听力康复·

The Effect of the PDE5 Inhibitor on Noise-induced Hearing Loss

Liang Yuan*，Zhang Shujun，Zhang Xun
(*Department of Otorhinolaryngology，Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde，067000，China)

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of the PDE5 inhibitor on noise-induced hearing loss.Methods 30 guinea pigs were randomly divided into control group，noise exposure group and PDE5 inbibiter group(10 in each).Two weeks after white noise exposure of 110 dB，sildenafil (10 mg·kg-1·d-1) and NS(4 ml·kg-1·d-1) were injected into guinea pigs of PDE5 inbibiter group and the noise group respectively.One week after noise exposure four weeks continuous administration was cavried out.The ABR thresholds and the PL of waveⅠwere measured respectively prior to the experiment，1 week post-noise，1，2 and 4 weeks post-drugs.The changes of cochlea hair cells were also observed by light microscopy.Results The ABR threshold shifts and the PL in sildenafil group were less obvious than that of in the noise group.The number of OHCs loss was relatively stable in the normal group，while the obvious OHC loss was observed in other groups.There was significant difference among the three groups，however，the OHC loss in the sildenafil treatment group was not significantly different from that in the noise exposure (P＞0.05).Conclusion The inhibitor of PDE5 is able to reduce the decrease of ABR thresholds shift，shorten the extension of the PL，and it can significantly protect against noise-induced hearing loss.

【Key words】Sildenafil; Noise-induced hearing loss; Hair cell

通讯作者:张淑君(Email: liangyuan12388@126.com)

作者简介:梁媛，女，河北人，主治医师，主要研究方向为耳科学。

【中图分类号】R764.43+3

【文献标识码】A

【文章编号】1006-7299(2015) 06-0622-04

DOI:10.3969/j.issn.1006-7299.2015.06.013