强直性脊柱炎患者细胞毒性T淋巴细胞变化

孟景红，魏 平，陈海英，王俊祥，谢建丽，张 颖

（河北医科大学第三医院免疫风湿科，河北 石家庄050051）

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性免疫相关性炎性疾病，起病隐匿，早期难以发现，致残率高，主要侵犯中轴关节，以骶髂关节炎为标志，但外周关节炎常为病程中的突出表现；慢性复发性和非特异性炎症是AS的显著特征，主要见于滑膜、关节囊、韧带或肌腱附着点。炎症引起附着点侵蚀，初期淋巴细胞、浆细胞及少数多核白细胞浸润，进而肉芽组织形成，最后受累部位钙化、新骨形成，导致关节功能受损而致残。其发病机制至今尚未完全明确。目前研究认为辅助T细胞（T helper cells，Th）细胞亚群失衡及其相关的细胞因子分泌异常与AS发生、发展密切相关，但细胞毒性T淋巴细胞（T-lymphocytes cytotoxic，Tc）细胞亚群在 AS发病中的意义鲜有报道。本研究观察AS患者外周血中Tc细胞亚群比例的变化，分析Tc细胞亚群比例变化特点和与疾病活动之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年10月—2013年10月河北医科大学第三医院免疫风湿科AS患者42例（病例组），符合1984年修订的纽约标准。男性33例，女性9例；年龄18～52岁，平均（32.4±9.3）岁；病程3～40年。所有患者均为初诊AS患者，既往均未应用抗风湿药物治疗。健康对照20例（对照组），男性16例，女性4例，年龄19～47岁，平均（29.5±8.4）岁。均来自健康查体者，既往无其他自身免疫性疾病，无激素类及免疫抑制剂等用药史。2组在性别、年龄等方面差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 临床指标 所有患者均检测HLA-B27、白细胞计数、血小板计数、C反应蛋白（C-reactve protein，CRP）、红 细 胞 沉 降 率 （erythrocyte sedimentation rate，ESR）等指标；并记录强直性脊柱炎病情活动指数调查表（Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index，BASDAI）评分。

1.3 研究方法 抽取所有入选者外周静脉血3 mL，以流式细胞仪检测外周血淋巴细胞表型（CD3＋CD8＋）、胞浆内细胞因子 γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素4（interleukin 4，IL-4）的表达。检测步骤如下：取4个5mL试管，管号为A1、A2、A3和A4，每管中分别加入100μL新鲜肝素钠抗凝全血。混匀后加入20μL环氧氯丙烷橡胶标记的CD3（CD3-ECD）和20μL 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标 记 的 CD8（CD8-FITC），室温、暗环境中孵育15min。每管中加入100μL固定液，室温、避光孵育15min。每管中加入5mL PBS，1 200r／min离心5min，弃上清。每管中加入100μL破膜和溶血液，同时A1管中加入小鼠IgG1-PE 10μL，A2管中加入IFN-γ-PE 10 μL，A3管中加入大鼠荧光标记的单克隆抗体（IgG1-PE）10μL，A4管中加入IL-4-PE 10μL。室温，避光孵育15min。每管中加入5mL PBS，1 200 r／min离心5min，弃上清。1mL PBS重悬细胞，上机检测。结果均以Tc中IFN-γ及IL-4表达的阳性百分率进行统计，并以同型对照抗体消除非特异性结合。

1.4 主要试剂和仪器 细胞表面标记抗体：CD3-ECD、CD8-FITC；胞浆内细胞因子抗体：IL-4-PE、IFN-γ-PE；同型对照：RatIgG1-PE（对应于IL-4-PE）、Mouse IgG1-PE（对应于IFN-γ-PE）均购美国Bekman Coulter公司；破膜剂：美国Caltag公司Fix＆Perm；应用美国Bekman Coulter公司生产的Epics-XLⅡ型流式细胞仪。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件包进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用2个独立样本t检验；相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比较 病例组具有CD3＋CD8＋受体的辅助性Tc细胞亚群和具有分泌IL-4细胞因子Tc2细胞亚群的比例均高于对照组（P＜0.01），而具有分泌TNF-γ的Tc1亚群和Tc1／Tc2的比例均低于对照组（P＜0.01），见表1。

表1 2组外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比较Table 1 Tc1，Tc2and Tc1／Tc2level in peripheral blood of patients group and control group(±s，%）

表1 2组外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比较Table 1 Tc1，Tc2and Tc1／Tc2level in peripheral blood of patients group and control group(±s，%）

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2.2 相关性分析 AS患者外周血Tc、Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比值与血小板计数、ESR、CRP、BASDAI评分均无相关性，见表2。

表2 AS外周血细胞因子与白细胞计数等指标相关性分析Table 2 Correlation analysis on cytochines，white blood cell count and other indexes in peripheral blood of AS patients

3 讨 论

T淋巴细胞根据其细胞表面特征性分子的不同可分为：CD3＋CD4＋T辅助性T细胞（Th）和CD3＋CD8＋细胞毒性T细胞（Tc）2个亚群。Tc细胞分为Tc1和Tc2 2个亚群，具有杀伤和调节功能，主要是通过分泌不同的细胞因子来介导；Tc1细胞以分泌IL-2及IFN-γ为特征，诱导细胞免疫反应为主；Tc2细胞以分泌肿瘤坏死因子α及IL-4等细胞因子为特征［1］。正常情况下，人体内Tc细胞的含量、功能活性以及Tc1／Tc2的比值是保持某种恒定状态的，彼此之间相互制约、相互调控，以维持机体的免疫稳态。该平衡在多种疾病的免疫学机制中起重要作用。而在感染、药物、精神因素等的作用下，机体内部可出现Tc淋巴细胞亚群的异常激活，导致Tc1／Tc2失衡及细胞因子的异常分泌，从而引起部分炎症相关性疾病［1］和免疫相关性疾病。樊超等［2］研究发现，在活跃期白塞病患者体内存在严重的免疫功能紊乱，主要表现在Tc细胞比例上调，而且Tc细胞内合成INF-γ的能力明显升高，导致Tc1细胞占据优势。而在稳定期患者体内Tc细胞比例及胞内合成INF-γ的能力与正常人相比差异无统计学意义。因此，检测Tc细胞百分比及其亚群失衡的变化可以预知机体免疫功能及疾病状态。已有文献报道，在类风湿关节炎［3-4］、系统性红斑狼疮［5-6］患者体内均存在Tc细胞数量的变化及Tc1／Tc2的失衡，虽然结果不尽一致，但均提示Tc细胞在自身免疫性疾病的发病中发挥着重要作用。而且最近有研究证明应用T细胞免疫接种疗法可以治疗类风湿关节炎［7］。充分证实上述观点。

国外亦有研究发现敲除CD4基因的小鼠仍可发生脊柱关节病，而敲除CD8基因的HLA-B27转基因大鼠的亦不能避免关节炎和结肠炎的发生［8］。提示在免疫介导的AS的发病机制中，与Th细胞一样，Tc细胞亚群失衡及其分泌的细胞因子发挥着重要性的作用。有研究显示，AS患者外周血中Tc细胞显著降低，Th细胞明显升高［9］。提示AS患者体内的确存在T细胞数量变化，但未进一步做关于Tc1／Tc2比值变化的研究。本研究结果显示，与正常对照组相比，AS患者外周血中Tc1细胞百分数减少，而Tc及Tc2细胞百分数增多、Tc1／Tc2比值降低。与胡冰等［10-11］研究结果是一致，说明在AS患者外周血中的确存在Tc1／Tc2的失衡，而且是Tc2细胞占优势。认为一种可能是Tc2细胞通过分泌肿瘤坏死因子α参与AS的病理反应；另一种可能为Th1细胞是关节炎症及病理性免疫反应的主要执行者，诱导了Tc2细胞的激活及向关节局部炎症部位的迁移，下调Th1细胞的活性，调节异常的免疫反应，从而控制疾病的进展。本研究相关分析显示AS患者外周血中Tc、Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比值与血小板计数、ESR、CRP、BASDAI评分均无相关性，表明与疾病活动度无关。

通过对Tc1／Tc2细胞平衡在AS中作用的研究，不仅有助于阐明AS的发病机制，而且有可能为我们提供治疗AS的新方法，即通过调节Tcl／Tc2细胞的动态平衡，调节过强的体液免疫或细胞免疫，从而达到治疗AS的目的。

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