Survivin siRNA对甲状腺乳头状癌细胞裸鼠移植瘤血管生成的影响

段睿，刘正人，张浩

(1.荆门市第一人民医院普通外科，湖北荆门448000；2.南昌大学第一附属医院普通外科，江西南昌330006)

Survivin siRNA对甲状腺乳头状癌细胞裸鼠移植瘤血管生成的影响

段睿1，刘正人2，张浩1

(1.荆门市第一人民医院普通外科，湖北荆门448000；2.南昌大学第一附属医院普通外科，江西南昌330006)

目的探讨凋亡抑制基因Survivin的小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)对甲状腺乳头状癌细胞株K1裸鼠移植瘤血管生成的影响。方法将表达特异性Survivin siRNA序列的质粒载体，与表达无关序列siRNA的质粒载体分别转染K1细胞；G418筛选出稳定表达Survivin siRNA和表达无关序列siRNA的K1细胞，与未转染的K1细胞分别注射于裸鼠皮下，观察三组移植瘤的生长速度。SP免疫组化法检测各组移植瘤中的微血管密度(MVD)。结果Survivin siRNA组比无关序列siRNA组肿瘤平均质量减少56%，比未转染组肿瘤平均质量减少63%；Survivin siRNA组MVD明显低于无关序列siRNA组及未转染组(P＜0.05)；无关序列siRNA组与未转染组MVD值差异无统计学意义(P＞0.05)。结论Survivin siRNA可抑制甲状腺乳头状癌细胞K1裸鼠移植瘤的微血管生成及肿瘤生长。

Survivin；siRNA；甲状腺癌；血管生成

甲状腺癌是一种常见的恶性肿瘤，超过90%的患者为分化型甲状腺癌(Differentiated thyroid carcinoma，DTC)，处于进展状态的晚期DTC尚缺乏有效的治疗方法。目前的研究表明凋亡抑制蛋白Survivin在DTC组织中表达上调上并与微血管生成关系密切[1]。我们寄希望于靶向构建Survivin的SiRNA载体能减少甲状腺癌肿瘤组织的微血管生成，以抑制肿瘤的生长。

1 材料与方法

1.1 细胞株、动物和试剂甲状腺乳头状癌细胞株K1购自欧洲细胞库；4～6周龄Ba1böc雌性裸鼠购自南昌大学医学动物实验中心；DMEM培养基购于GIBCO公司；转染试剂Lipofectamine 2000、胎牛血清(FCS)购于Invitrogen公司；抗生素G418购于Merck公司。PcDNA3质粒购于武汉晶赛公司；CD34鼠抗人单克隆抗体、SP免疫组织化学试剂盒购于北京中山生物有限公司；含Survivin siRNA的PcDNA3-siRNA质粒由南昌大学医学实验中心构建。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染K1细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，转染前调整细胞密度2×105/孔，培养过夜使得细胞融合率为50%～60%。按2.5µg质粒比4µl转染试剂Lipofectam ine 2000的比例混合，转染过程参照Lipofectam ine 2000试剂说明书。

1.2.2 筛选稳定表达siRNA的细胞克隆细胞转染48 h后更换含G418的培养基，调节G418浓度至1 mg/ml，培养21 d后在荧光电子显微镜下选取表达绿荧光蛋白的细胞克隆，并扩大培养备用。

1.2.3 移植肿瘤模型雌性裸鼠随机分为未转染组、无关序列siRNA组、Survivin siRNA组，每组10只。每只裸鼠腋部皮下注射约0.1 ml PBS悬浮的细胞悬液，细胞密度为5.0×106/ml，分别为未转染的K1细胞、表达无关序列siRNA的K1细胞、稳定表达Survivin siRNA的K1细胞。10周后颈椎脱臼法处死裸鼠，完整切除肿块，物理天平测量肿瘤质量后置于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，连续切片。

1.2.4 肿瘤组织微血管密度(MVD)的检测按SP试剂说明书以CD34标记MVD，一抗采用CD34鼠抗人单克隆抗体，以染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞丛作为1个微血管计数。先在40倍显微镜下观察整张切片，确定切片中3个血管密度最高区域，然后在200倍镜下计数该3个区域内染色的微血管数目，取其平均值作为该标本的MVD。

1.3 统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，并选用两独立样本比较的t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

裸鼠腋部皮下注射K1细胞后全部成瘤，第10周末三组裸鼠的皮下移植肿瘤大小差异显著，Survivin siRN组比无关序列siRNA组肿瘤平均质量减少56%，比未转染组肿瘤平均质量减少63%，见表1。

表1 三组裸鼠皮下移植肿瘤生长及微血管生成的比较(±s)

注：a与b两组比较，t=1.571，P=0.134；a与c两组比较，t=10.342，P= 0.000；b与c两组比较，t=10.226，P=0.000。

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3 讨论

RNA干扰(RNAi)是将双链RNA导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程，是转录后基因沉默的一种技术，具有高效性、特异性以及多功能性的优点[2]。小干扰RNA(siRNA)是RNAi的效应分子，自从Elbashir等[3]的研究发现siRNA在哺乳动物细胞中能降解同源序列靶基因的mRNA以来，体外合成siRNA为哺乳动物基因治疗开创了新的道路。

Survivin属于凋亡抑制蛋白家族成员，在分化型甲状腺癌组织中表达上调，并与肿瘤微血管生成关系密切，在分化型甲状腺癌的发生、发展中起重要作用，有望成为甲状腺癌诊断和治疗的新靶点[4-6]。同时由于Survivin特异性地表达于肿瘤组织，在正常成人组织几乎不表达，使得Survivin的靶向治疗具有良好特异性及安全性。

富凯等[7]的研究表明：Survivin siRNA能够抑制腺样囊性癌瘤体生长，并在体内通过抑制腺样囊性癌VEGF表达有效减少肿瘤血管生成。我们将稳定表达Survivin siRNA和表达无关序列siRNA的K1细胞，与未转染的K1细胞分别注射于裸鼠皮下，观察三组移植瘤的生长速度；SP免疫组化法检测各组移植瘤中的微血管密度(MVD)。结果提示：Survivin siRNA组比无关序列SiRNA组肿瘤平均质量减少56%，比未转染组肿瘤平均质量减少63%，说明Survivin siRNA可抑制甲状腺乳头状癌细胞K1裸鼠移植瘤的生长。Survivin siRNA组较其他两组MVD值明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；未转染组与无关序列SiRNA组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，说明Survivin siRNA可抑制甲状腺乳头状癌细胞K1裸鼠移植瘤的微血管生成。本结果提示Survivin siRNA可能通过抑制甲状腺乳头状癌细胞K1裸鼠移植瘤的微血管生成从而抑制肿瘤的生长。

由于Survivin在肿瘤的生长及血管生成方面发挥着重要的作用，提示survivin siRNA在甲状腺乳头状癌的治疗中具有重要的潜在价值，本研究可以为临床上采用以Survivin为靶点基因治疗提供一个理论证据。

[1]马静,李晓江,隋军,等.survivin在甲状腺癌中的表达及与微血管生成的关系[J].肿瘤防治研究,2010,37(10):1149-1151.

[2]Aagaard L,Rossi JJ.RNAi therapeutics:principles,prospects and challenges[J].Adv Drug Deliv Rev,2007,59(223):75-86.

[3]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells [J].Nature,2001,411(6836):494-498.

[4]吴泽建,谢楚平,蒋基令,等.甲状腺癌中Survivin与VEGF因子的表达及其临床意义[J].中国现代医学杂志,2011,21(10): 1158-1160.

[5]卢秀波,安兆峰,王庆兆,等.Survivin和c-myc在分化型甲状腺癌中的表达及临床意义[J].中华实验外科杂志,2004,21(6): 705-706.

[6]Chen Z,Liu N,Zhu G,et al.Targeting of the anti-apoptotic gene survivin in human thyroid carcinoma[J].Int J Mol Med,2012,30 (03):465-472.

[7]富凯,杨军,汪欣,等.Survivin siRNA抑制人腺样囊性癌ACC 22细胞移植瘤血管生成[J].第三军医大学学报,2010,32 (16):1750-1753.

Effects of survivin siRNA on angiogenesis of papillary thyroid carcinoma xenografts in nude mice.

DUAN Rui1, LIU Zheng-ren2,ZHANG Hao1.1.Department of General Surgery,the First People's Hospital of Jingmen City,Jingmen 448000,Hubei,CHINA;2.Department of General Surgery,the first Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of survivin small interfering RNA(siRNA)on angiogenesis of papillary thyroid carcinoma K1 cell xenografts in nude mice.MethodsK1 cells were transfected through Lipofectamine 2000 and selected by G418.K1 cells transfected with survivin siRNA-plasmid(survivin siRNA group),K1 cells transfected with non-silencing-plasmid(non-silencing siRNAgroup)and K1 cells without transfection(non-transfection group)were inoculated into nude mice,respectively.Microvessel density was measured by immunohistochemistry staining.ResultsThe mean tumor size of murine xenograft in survivin siRNAgroup was reduced by 56%and 63%compared with non-silencing siRNA group and control group,respectively.Microvessel density in survivin siRNA group were significantly decreased compared with non-silencing siRNA group and control group(P＜0.05),whereas no significant difference was noted between non-silencing siRNA group and control group(P＞0.05).ConclusionSurvivin siRNA can inhibit angiogenesis and growth in papillary thyroid carcinoma K1 cell xenografts.

Survivin;siRNA;Thyroid carcinoma;Angiogenesis

R-332

A

1003—6350（2015）01—0005—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0002

2014-04-07)

湖北省卫生厅科研指导性项目(编号：JX4C36)

张浩。E-mail:431800zhanghao@sina.com