GRK5功能缺失与阿尔茨海默病的相关性研究进展

赵仲艳，何祥英，吴婵姬，文国强，黄仕雄

(海南省人民医院神经内科，海南海口570311)

GRK5功能缺失与阿尔茨海默病的相关性研究进展

赵仲艳，何祥英，吴婵姬，文国强，黄仕雄

(海南省人民医院神经内科，海南海口570311)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的发病机制涉及到很多方面，新近研究表明G蛋白信号转导途径异常在AD的发病中起着重要作用。AD患者脑中信号转导活性明显增强，且信号转导缺陷的位点出现在“受体-G蛋白界面”，研究表明G蛋白耦联受体激酶(GRKs)功能缺陷，主要是GRK5，与AD的发生联系密切。

GRK5；功能缺失；阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种起病隐袭的进行性发展的神经系统退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍，是老年期痴呆最常见的类型。AD的病理学特征主要包括细胞外β-淀粉样斑块(老年斑)、神经纤维缠结、神经元和神经突触异常丢失等[1]。随着社会老龄化现象日益严重，AD的患病率逐年增高，现已成为导致老年人死亡的第四位主要原因。虽然对AD的研究已有100多年的历史，并且提出多种发病机制，但至今其病因仍未明确，因此对该病目前仍无有效的治疗措施。而与此同时，这个特殊患者群体的治疗费用也因治疗措施的昂贵而不成比例的增加，因此充分理解AD发病机制对提高其预防治疗水平是非常迫切的。新近的研究表明G蛋白信号转导途径异常在AD的发病中起着重要作用。研究者们指出AD信号转导缺陷的位点出现在“受体—G蛋白界面”，即G蛋白耦联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases，GRKs)主要的作用位点，其中以GRK5(G protein-coupled receptor kinases-5，GRK5)与AD发病的关系最为密切。本文将详细的阐述GRK5功能缺失与AD之间的相关性。

1 GRKs简介

1.1 GRKs的种类、结构及分布GRKs属于丝/酪氨酸蛋白激酶家族，主要功能是对G蛋白耦联受体(G Protein-coupled receptors，GPCRs)进行磷酸化，抑制受体及下游信号的持续激活，介导GPCR的脱敏反应[2]，在多个生理系统中都发挥着广泛而多样的调节作用，介导多种生理功能、病理过程及药物作用。GRKs家族迄今已发现7种亚型，按发现时间顺序分别命名为GRK1～GRK7。而根据序列同源性及活性调控作用机制相似性它们又可分为3个亚家族：视紫红质激酶亚家族(GRK1和GRK7)、β肾上腺素受体激酶亚家族(GRK2和GRK3)、GRK4亚家族(GRK4、GRK5和GRK6)。不同家族成员的分布、底物各有特异性，调节方式也不完全相同，所表现出的生理功能也有所差异。视紫红质激酶亚家族主要分布在视网膜，β肾上腺素受体激酶亚家族广泛分布在心、脑、肺、肾、骨骼肌等组织[3]，GRK4亚家族中的GRK4仅在睾丸高水平表达[4]，GRK5、GRK6则在全身各组织均有表达，作用底物广泛。不同的GRKs异构体具有各自相应的选择性底物：如GRK2基因敲除(GRK2KO)小鼠可以选择性的减低对肾上腺素能受体的去敏感化，GRK6KO小鼠显示出对多巴胺能超敏性[5]，易发生自身免疫性疾病[6]；而GRK5KO小鼠则表现出对乙酰胆碱能受体去敏感化功能的减弱[7]。尽管如此，所有的GRKs成员都拥有一类似的结构组成：一个位于细胞外N-末端由约185个氨基酸残基组成的弱保守区，一个由263～265个氨基酸残基组成的蛋白激酶催化区，和一个细胞内由100～230个氨基酸残基组成的C-末端区。

1.2 GRKs的功能GRKs的主要功能是使活化的GPCRs脱敏化，这个负性调节过程包括：活化受体的磷酸化、受体-G蛋白结合的解耦联化及启动受体的内在化。GRKs磷酸化激活状态下的GPCRs，受体磷酸化后与抑制蛋白(Arrestin)结合，使受体与G蛋白脱耦联，引起受体脱敏。受体与抑制蛋白结合后参与网格蛋白(Clthrin)磷酸化的受体重新敏感化，并将其运回细胞膜再次利用[2，8]。因此，位于G蛋白-受体界面的GRKs的主要功能就是使激活状态下的GPCRs发生脱敏，调节多种信号转达过程。

1.3 GRKs GPCRs在受体去敏感化中的作用GPCRs是一个大家族，包括M型乙酰胆碱受体、肾上腺素受体、血管紧张素Ⅱ受体等等。GPCRs在中枢神经系统内对正常脑功能的维持具有极其重要的作用，它们与相应的受体激动剂结合后，通过与细胞膜内侧的G蛋白耦联，由G蛋白将信号传递至细胞内，继而产生一定的效应从而对细胞发挥作用。激动剂持续作用于GPCRs时，GPCRs对激动剂的敏感性往往会下降，导致激动剂的效应性降低，称为去敏反应[2，9]。研究认为GPCRs的磷酸化、调节蛋白β-arrestin与磷酸化的受体的结合而导致受体的内吞以及受体的下调等都是GPCRs减敏的主要机制[9]。目前认为GRKs和Arrestins两大蛋白家族介导了这一快速的同源减敏：GRKs先结合并磷酸化被激动剂占领的GPCRs，GPCRs被磷酸化后与Arrestins蛋白结合，使其与G蛋白脱耦联并发生内吞，阻止GPCRs与G蛋白发生作用，造成GPCRs功能减退，进而调控细胞内信号传递的级联反应。此外，如果GRKs功能出现异常，那么激活的GPCRs与它们对应的G蛋白脱耦联而启动受体的内在化势必会出现障碍，从而引起下游信号分子的持续激活而出现过度反应[2，9]。

1.4 GRK5作为GRKs家族中的一员，GRK5除具有GRK家族的共同特点外还有其自身的特殊点。GRK5由590个氨基酸残基构成，广泛分布于全身多种器官，对多种GPCR具有选择性的调节作用，在循环系统、呼吸系统、神经系统等系统生理功能调节中发挥着重要作用[4]。GRK5的mRNA在脑组织中也有广泛表达。在中枢神经系统，GRK5的mRNA适度表达于边缘系统、扣带皮质、隔-海马核、丘脑前核、海马椎体齿状回、中央松果体、蓝斑和小脑皮质，以侧间隔处的表达水平最高[10]。GRK5多表达于神经递质的分泌处，这说明GRK5在神经系统信号转导中起着重要作用。根据GRK5的分布和功能研究确定出了它的结构和功能域：N-末端磷脂酰环己六醇-4，5-二磷酸(PIP2)结合域、磷脂结合域、自体抑制结构域、两个钙调蛋白(CaM)结合域以及DNA结合细胞核定位序列。PIP2结合域和磷脂结合域具有促进GRK5与膜结合的功能，这使GRK5能够直接和磷脂层结合，这与GRK1、GRK4和GRK6通过与脂质的共价修饰结合而与膜磷脂结合不同，属于GRK5特有的性质之一[11]。CaM结合区的存在使Ca2+/CaM与GRK5的CaM结合位点直接作用，促使了GRK5的核输出作用[12]。GRK5除了可以介导多种GPCR信号转导外，它还能够结合并调节胞浆中多种非受体底物,有特殊的核定位信号序列，能发生细胞核—胞浆的穿梭，并可结合和影响转录因子[4]。由于GRK5参与了多种细胞信号系统的转导，因此其可能与心脏病、高血压病、药物成瘾性和帕金森病、阿尔茨海默病等疾病的发生有关。目前对GRK5的研究多集中在这些疾病中。

2 GRKs与AD的关系

神经信号传导系统失衡是AD的一病理学特征。主要表现为：(1)增强某些蛋白激酶的活性和(或)降低某些蛋白磷酸化酶的活性将有助于神经纤维变性[13]；(2)增加Aβ蛋白水解产生或降低Aβ蛋白的清除会使脑组织出现β-淀粉样改变[14]；(3)过度激活神经小胶质细胞和星形胶质细胞会导致神经元出现炎症性损伤[15]。研究发现，AD患者的大脑信号传导系统普遍处于功能极度活跃的状态[16]，特别是各种GPCRs及其下游信号。更为具体的是，多位研究者指出信号转导缺陷的位点出现在“受体-G蛋白界面”，即GRKs的主要作用位点[17]。Suo等[18]于2004年最早提出了GRKs功能紊乱与AD发病相关的理论。研究显示功能性(膜上)GRK5缺陷与Aβ沉积及早期AD存在联系，并发现阈下剂量Aβ可以诱导细胞膜上GRKs减低而胞浆内GRKs聚积[19]。更有意义的是在早期AD转基因动物和患者体内均存在GRKs表达异常[18]。机理研究揭示GRKs功能缺陷引起的受体脱敏障碍可能为AD致病因素创造了一种易感环境[20]。所有这些都表明GRKs功能异常引起的GPCRs受体脱敏障碍在AD发病机制中具有重要潜在作用。

3 GRK5 功能缺失与AD的相关性

3.1 导致GRK5缺失的因素胞膜结合力和胞质结合力之间的平衡调节决定了GRK5的亚细胞定位[21]，然而与AD或衰老有关的因素可以打破这一调节平衡导致膜GRK5的缺失。事实上，随着年龄增长GRK5的总量是逐渐增多的，但与低龄小鼠相比，老龄化小鼠表现出严重的膜GRK5缺失，在AD中GRK5的缺失则更为严重，由此亦提示膜GRK5的缺乏与衰老中的基因变异可能有关。此外，研究已证实低剂量可溶性Aβ[18]、谷氨酸、同型半胱氨酸及氧化应激等都可导致膜GRK5的缺失[22]。

3.2 GRK5功能缺失与AD的相关性

3.2.1 GRK5功能缺失会出现早期AD的病理学特征GRK5基因的缺失同早期AD的病理改变具有密切的联系[18，20，23]：(1)在体外低剂量可溶性Aβ预处理后，胞膜上的GRK5迅速移至胞质，使得GRKs的活性受到抑制，凝血酶信号通路中的GRCP受体不能及时脱敏，最终导致预处理后的细胞极度活跃。在转基因鼠及AD患者死后尸解的脑内同样存在此种情况[18]。(2)GRK5KO小鼠的动物模型认知行为学测试研究发现，GRK5KO小鼠可以出现选择性的工作记忆障碍，而其他方面的认知功能没有受到损害，同时动物脑内总的乙酰胆碱(Ach)水平下降。同时研究还发现在GRK5KO小鼠显示年龄相关的海马区神经轴突的肿胀、缺失，严重时可以在部分小鼠中发现细胞外γ-淀粉样纤维沉积，同时伴有轴突成分的变性。其脑内典型的病理改变为小鼠海马区内不典型的神经炎性斑块(Neuritic plsques，NPs)的增加。高倍镜下的研究显示这种NPs为一种由异常磷酸化的Tau蛋白聚集的，伴有NFT阳性蛋白的包绕的早期的营养不良性的未成熟的炎性斑块[23]。(3)具有人β-淀粉样前体蛋白(β-APP)基因突变的小鼠中同时进行GRK5基因敲除(GRK5KO)后，可以发现轴突的缺失和轻微的胆碱能神经元变性而导致的轻度认知功能障碍，而且当β-APP在GRK5KO小鼠中过表达时，具有这种双重基因突变的小鼠脑内炎症改变明显的加重[20]。

3.2.2 GRK5功能缺陷对机体损害具有一定的选择性mAchR受体属于GPCR受体家族，在持续的胆碱能刺激下胆碱能受体的去敏感化和复敏功能的正常是维持细胞内乙酰胆碱能神经递质传递的重要前提。目前已知5种mAChR亚型(M1、M2、M3、M4和M5受体)。在海马区域中的M受体主要是M1、M2和M4，其中M1受体位于突触后膜，M2/M4受体则位于突触前膜。已有研究证明，AD动物模型脑内突触后M1受体的信号减弱，同时会增加Tau蛋白磷酸化水平，导致神经纤维的变性，体外实验已证实M1受体激动剂可以降低Tau蛋白的磷酸化；而且M1、M3和M5受体信号显示具有抗凋亡作用[24]，而M2和M4受体则无类似作用。目前已公认海马区内Ach水平的减少可导致胆碱能神经元中Tau蛋白磷酸化，加重神经纤维的变性以及细胞的凋亡。研究发现用毒蕈碱刺激GRK5KO小鼠可引起中枢和外周反应，且这种反应主要是由M2受体的功能受到调节所导致[25]，这提示GRK5缺陷对于M2的影响具有亚型选择性，且已有研究证实了这一发现并进一步论述这种选择性主要针对mAchR受体中全部M2、部分M4，但不包括M1[26]。GRK5功能缺陷可引起突触前M2受体信号的延长或突触前胆碱能过度活跃，而突触前胆碱能过度活跃反过来会降低海马记忆回路中Ach的释放，使得包括突触后M1在内的突触后胆碱能活动减退[26]。这可能是促成与AD密切相关的海马内胆碱能功能低下的原因。

3.2.3 GRK5缺失可增强低浓度Aβ潜在的毒性效应高浓度的Aβ对神经元、星型胶质细胞和血管内皮细胞具有直接的毒性作用,并可导致剂量依赖性的小胶质细胞激活[27]。这意味着当Aβ浓度低于致细胞毒性的域值，即域值浓度以下(Sub-threshold)时，它所导致的多种有害效应将会难以观察到，但是这并不意味着域值下浓度的Aβ没有任何效应。有研究表明域值浓度下的Aβ可明显增强内皮缩血管肽-1 (Endothelin-1)所致的血管收缩[28]，引起脑血流量降低，且这亦可发生在早期AD患者中[29]。进一步的研究表明，域值浓度下A 可通过激活一定的GPCR受体(如凝血酶、谷氨酸等)而导致海马小胶质细胞的激活并且可能促进Tau蛋白的过度磷酸化和聚集[20-30]。GRK5缺失会导致GPCR去敏感化降低，增强GPCR对相应受体的刺激反应度，因此针对一定的GPCR刺激，域值浓度下Aβ似乎可以增加细胞的敏感性及反应性[18]。

3.2.4 GRK5缺失为两种假说之间联系的纽带在AD众多的发病假说中，Aβ淀粉样蛋白沉积假说和胆碱能损伤假说是目前广为接受的两种。前者认为AD发病的核心是Aβ在脑内沉积；后者则提出中枢胆碱能神经功能障碍是AD认知功能下降的主要原因。而GRK5功能缺陷可成为联系二者之间的桥梁：一方面Aβ是诱导GRK5缺乏的主要因素之一；另一方面GRK5缺乏会选择性地导致胆碱能功能损伤。由此形成一恶性循环，导致Aβ异常积聚和胆碱能异常，加速AD的病理进程。

综上所述，GRK5基因缺陷同AD的早期的病理改变以及动物认知水平下降具有密切联系，且GRK5基因缺陷可致M2/M4受体去敏感化作用的减弱进而引起乙酰胆碱水平降低，这些将为今后进一步评估目前对于试图通过纠正低胆碱能活性治疗AD的策略，以及纠正GRK5的缺陷对于阻止或延缓AD疾病进展的作用提供重要的理论基础。

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Research progress in the correlation study between GRK5 deficiency and Alzheimer's disease.

ZHAO Zhong-yan,HE Xiang-ying,WU Chan-ji,WEN Guo-qiang,HUANG Shi-xiong.Department of Neurology,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

The pathogenesis of Alzheimer's disease(AD)involves many aspects.Recent studies have shown that the G-protein signal transduction deficits play important roles in the pathogenesis of AD.The signal transduction activity in AD brain is significantly enhanced,and the site of the signal transduction defects is at the“receptor-G protein interface”.Studies have indicated that the G protein-coupled receptor kinases(GRKs)functional deficiency,primarily GRK5,plays a significant role inAD pathogenesis.

G protein-coupled receptor kinase5(GRK5);Function deficiency;Alzheimer's disease

R741

A

1003—6350（2015）01—0082—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0025

2014-05-22)

赵仲艳。E-mail：zzyzhongyanzhao@163.com