超声及超声微泡介导基因转染的安全性研究*

西安交通大学第二附属医院急诊科(西安710004)

潘龙飞 李丽君▲ 余 蕾△ 丁新爱 殷美静

·论著·基础研究·

超声及超声微泡介导基因转染的安全性研究*

西安交通大学第二附属医院急诊科(西安710004)

潘龙飞 李丽君▲余 蕾△丁新爱 殷美静

目的：探讨超声及超声微泡介导基因转染的安全性。方法：将人脐静脉内皮细胞分别按超声辐照时长及所加入的微泡剂量分组，超声辐照后分别培养24h及48h,应用台盼蓝拒染法进行细胞计数，与对照组进行比较。超声辐照含有不同微泡剂量的细胞后,行扫描电镜观察细胞膜形态。结果：不同辐照时长组经超声辐照后培养24h,10min、15min、30min组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P<0.05)；继续培养48h，各组与对照组比较无统计学差异。不同微泡剂量组经超声辐照5min后培养24h,200μl、500μl组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P<0.05)；继续培养48h,500μl组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P<0.05)。扫描电镜可见超声辐照后细胞膜完整性变差,继续培养24h后有一定程度改善。结论：超声辐照+微泡对细胞增殖有一定的抑制作用,对细胞膜有一定程度的损害,但这些作用在超声辐照时长不超过5min及微泡剂量不超过100μl时是轻微、可逆的。超声及超声微泡介导基因转染是相对安全的。

近年来，基因治疗成为医学多个专科研究的热点，如心血管领域研究的“分子搭桥”，可以采用的基因有多种[1]，却没有公认的安全、高效的靶向转染的方法。由于基因转染的方法及载体决定了转染的安全性及效率，因此围绕该方向有较多的实验研究。自1996年Unger等[2]首次利用超声微泡造影剂(后文简称微泡)作为基因转染的载体，并通过超声辐照实现靶向基因转染后，国内外有多篇相关研究报告，作者也验证了该方法的可行性[3]。虽然目前有较多采用该方法进行基因转染的研究报告，但其安全性尚无定论，因此，作者设计该实验，以探讨在特定微泡存在的情况下，超声介导基因转染的安全性。

材料与方法

1 材 料 HUVEC(人脐静脉内皮细胞)：由西安交通大学药理学教研室惠赠。CK30倒置显微镜：Olympus，日本。BX60显微照相系统：Olympus，日本。Logiq 7全息彩色多普勒超声诊断系统：GE，美国。DMEM培养基：Gibco，美国。SonoVue超声微泡造影剂：Bracco，意大利。配置微泡：每瓶SonoVue (含SF659mg，冻干粉25mg)用5ml 注射用生理盐水(9g/L NaCl)溶解，剧烈震荡20s，至瓶内药物混合均匀。

2 HUVEC的准备 选用对数生长期HUVEC，制备成单细胞悬液，按1×106/ml的密度，加100μl至无菌1.5ml离心管(Ep管)

3 超声及超声微泡造影剂对HUVEC增殖的影响 ①按照超声辐照时长分为对照(无辐照)组、20s、1min、5min、10min、15min、30min组；每管加入100μl微泡。②按照加入的微泡剂量分为对照(无微泡)组、100μl、200μl、500μl组；参考上步骤实验数据，选择5min作为辐照时长。所有组均用DMEM培养液调整体积至0.5ml。随后,将Ep管置于37℃水浴,用7L线阵探头(MI=1.5、f=8MHz、Depth=2cm)在距离Ep管2cm处按分组进行辐照；Ep管另一侧置一橡胶块吸收回波反射。随后，细胞分别继续培养24h、48h后，应用台盼蓝拒染法进行细胞计数。

4 超声及超声微泡对HUVEC细胞膜的影响 分为5组，每组3管。超声辐照时长5min。A ：对照组(无微泡)；B：100μl微泡，辐照后即刻观察；C：100μl微泡，辐照后继续培养24h观察；D：200μl微泡，辐照后即刻观察；E：200μl微泡，辐照后继续培养24h观察。用DMEM培养液调整体积至0.5ml。所有分组经甩片、固定后，扫描电镜观察细胞形态。

结 果

1 对HUVEC细胞增殖的影响 ①见表1，各组微泡剂量相同，超声辐照后继续培养24h，可见10min、15min、30min组细胞计数与对照组比较有统计学差异(P<0.05)；继续培养48h观察，不同辐照时长组细胞计数与对照组比较无统计学差异。说明：在微泡存在的情况下，超声辐照对细胞增殖有一定抑制作用；这种作用是轻微的、可逆的；辐照时间不超过5min是相对安全的。②见表2，各组超声辐照5min后继续培养24h，可见200μl、500μl组细胞计数与对照组比较有统计学差异(P<0.05)；继续培养48h观察，500μl组细胞计数与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。说明：随微泡剂量增加，超声辐照对细胞增殖的抑制作用逐渐增加；这种作用是轻微的、可逆的；微泡剂量不超过100μl是相对安全的。

表1 各辐照时长组台盼蓝拒染法活细胞计数

注：与对照组比较，*P<0.05

表2 各微泡剂量组台盼蓝拒染法活细胞计数

注：与对照组比较，*P<0.05

2 对HUVEC细胞膜影响 见附图。B、C、D、E组较对照组(A)细胞膜完整性差，一部分细胞表面呈皱折状突起，出现大小不等、数量不一、圆形或不规则形的小孔及裂隙，1～4μm左右，说明超声+微泡可能对细胞膜造成损害，尤其高微泡剂量的D、E组(200μl微泡)明显；继续培养24h后(C、E)，分别与相应辐照后即刻观察组(B、D)相比，皱折状突起、小孔及裂隙减少，说明超声+微泡对细胞膜的损害是可逆的。如图F箭头所指小孔，可能为超声介导基因转入细胞的途径。

讨 论

Y超声辐照液体可以产生空化作用，即一定强度的超声辐照所产生的交变压可以形成微气泡并导致其发生“爆破”，进而产生一系列的物理、化学效应。液体中加入微泡造影剂，可以加强这种效应。一定强度的超声作用于微泡造影剂后，可使其“爆破”并产生微射流，进而在细胞膜上形成孔洞，促进携带的目的基因进入细胞；同时，超声作用本身还可使细胞膜产生跨膜电流，导致细胞膜开放，进一步促使胞外的基因进入细胞。

1996年Unger等[2]利用上述原理，开创了利用超声+微泡造影剂靶向传输药物、基因的先河。1998年Richard等[4]利用超声及Optison微泡向大鼠骨骼肌靶向传输标记红细胞及聚胶体取得成功。同年,Greenleaf等[5]利用超声及Albuex蛋白微泡将绿色荧光蛋白基因(GFP)的质粒，成功导入培养的人软骨细胞内,证实转染效率增加了3～4倍。2000年Lawrier等[6]报告超声波辐射可使单纯裸质粒基因在心血管的转染效率增加10倍,可使质粒脂质体法的转染效率再增加3倍，如果使微气泡与质粒混合，则比单纯裸质粒的转染效率增加300倍,如果使用的微泡是脂质体微泡则基因转染效率将比单纯裸质粒基因的转染效率增加3000倍。2005年，Korpanty等[7]经静脉注射自制微泡,在超声作用下将hVEGF165定向转移到了大鼠心肌中，试验结果表明治疗组的心肌毛细血管和小动脉密度显著增加。我们课题组也试验证实应用超声辐照，可以将与SonoVue微泡充分孵育的GFP质粒导入培养的人血管内皮细胞，未采用超声辐照组未见表达[3]。

A ：对照组(无微泡)；B：100μl微泡，辐照后即刻观察；C：100μl微泡,辐照后继续培养24h观察；D：200μl微泡,辐照后即刻观察；E：200μl微泡,辐照后继续培养24h观察；F：图B局部放大图(30K倍)

尽管超声+微泡促进基因转染的可行性得到了验证，但超声+微泡介导基因转染时，如果强度过大，可能造成细胞的不可逆性损伤，即使成功转染了基因，却可能导致大量细胞死亡[8-10]，失去了治疗的价值。因此，我们设计实验，选用90%直径低于6pm且在国内容易采购并普遍采用的SonoVue微泡，用超声辐照后，行细胞计数并观察细胞膜状态，以探索超声+微泡介导基因转染的安全性。结果，实验提示，超声辐照+微泡对细胞增殖有一定的抑制作用，对细胞膜有一定程度的损害，但这些作用在一定的超声辐照时长及微泡剂量范围内是轻微、可逆的，超声及超声微泡介导基因转染是相对安全的。

然而，超声在细胞悬浮液中与在组织或器官中产生的空化效应是不同的。在体内，细胞之间和细胞周围的液体相对较少，超声的空化作用会受到限制，且超声在组织、器官中的衰减与体外环境也不相同，因此，将在动物实验中进一步探讨。

[1] 潘龙飞, 李丽君, 余 蕾. AKT对低氧模型细胞的促增殖作用[J]. 重庆医学, 2013, 42(13)：1441-1443, 1446.

[2] Unger EC, Hersh E, Vannan M,etal. Gene delivery using ultrasound contrast agents[J]. Echocardiography, 2001, 18(4)：355-361.

[3] 潘龙飞, 李丽君, 余 蕾. 超声及超声微泡介导基因转染的可行性研究[J]. 西安交通大学学报：医学版,2012,33(5)：661-663.

[4] Richard JP, Danny MS, Sanjiv K,etal. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound[J]. Circulation, 1998, 98：1264-1267.

[5] Greenleaf WJ, Bolander ME, Sarkar G,etal. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection[J]. Ultrasound in Med. & Biol,1998, 24(4):587-595.

[6] Lawrie A, Brisken AF, Francis SE,etal. Microbubble-enhanced ultrasound for vascular gene delivery[J]. Gene Ther, 2000, 7(23)：2023-2027.

[7] Korpanty G, Chen S, Shohet RV,etal. Targeting of VEGF-mediated angiogenesis to rat myocardium using ultrasonic destruction of microbubbles[J]. Gene Therapy, 2005, 12(17)：1305-1312.

[8] Miller DL, Quddus J. Lysis and sonoporation of epidermoid and phagocytic monolayer cells by diagnostic ultrasound activation of contrast agent gas bodies[J]. Ultrasound Med Biol, 2001, 27(8)：1107-1113.

[9] Feril LB JR, Kondo T, Zhao QL,etal. Enhancement of ultrasound-induced apoptosis and cell lysis by echo-contrast agents[J]. Ultrasound Med Biol, 2003, 29(2):331-337.

[10] 赵丽荣, 王小丛, 杨松青, 等.诊断剂量超声联合超声造影剂照射对体外培养成纤维细胞细胞膜影响的实验研究[J].中国实验诊断学, 2007, 11(7)：949-951.

(收稿：2014-03-28)

Security of gene delivery mediated by ultrasound and microbubbles

Emergency Department, the Second Affiliated Hospital,of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Pan Longfei Li Lijun Yu Lei et al

Objective：To investigate the security of ultrasound-and microbubble-mediated gene delivery. Methods：24h or 48h after HUVEC, which was divided into different groups according to exposure time or microbubble does, was exposed to ultrasound, the number of living cells was counted by trypan blue exclusion assay, and comparison was made. Then, Observations were done by scanning electron microscopy. Results：After 24h-culture, compared with that in control group, cell count was decreased significantly in 10 min, 15 min and 30 min group (P<0.05), and after 48h-culture, there were no differences among the different exposure-time groups. 24h-culture after the cells in different microbubble-does groups were exposed to ultrasound for 5 min, compared with that in control group, cell count was decreased significantly in 200μl and 500μl group (P<0.05), and after 48h-culture, cell count was decreased significantly in 500μl group (P<0.05). Observed by scanning electron microscopy after exposure, we found that the integrity of the cell membrane became worse, and after 24h-culture, it could improve to some extent. Conclusion：Exposure by ultrasound with microbubble can inhibit the proliferation of cell and impaired the cell membrane to some extent. However, these functions are limited and reversible when the exposure time is no more than 5min and the microbubble does is no more than 100μl. Ultrasound- and microbubble-mediated gene delivery is relatively safe.

Microbubble Ultrasound Transgene Transfection

*国家自然科学基金资助项目(30370579)

▲通讯作者

△西安医学院

微泡 超声 转基因 转染

R331

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.001