钠尿肽分子的人工改造及其舒血管功能的评价*

西安医学院第二附属医院中心实验室(西安710038)

于 军 铁 茹 王建榜 张学策 常 盼 朱妙章▲

钠尿肽分子的人工改造及其舒血管功能的评价*

西安医学院第二附属医院中心实验室(西安710038)

于 军 铁 茹 王建榜 张学策 常 盼 朱妙章▲

目的：对天然的钠尿肽(NPs)分子进行改造，并比较新型NPs分子的舒血管效应。方法：根据天然NPs的构效关系,人工设计合成了7种新型的NPs分子：CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC。进而采用离体血管灌流实验评价新型NPs的血管舒张活性,并与天然钠尿肽ANP、BNP、CNP进行比较。结果：血管舒张活性排序为：CNP>CNAAC>BNAAC>BNBAC>ANCAC>ANP>BNP>ANBAC>BNCAC>CNBAC。结论：新型设计的NPs具有其亲本分子的活性,可能成为治疗心血管疾病的新型候选药物。

钠尿肽(NPs)是一个结构相似但基因不同的肽类家族，包括心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)、C型钠尿肽(CNP)、树眼镜蛇利尿钠肽(DNP)和尿钠素(URO)等。它们在维持心血管和肾脏的稳态方面扮演着重要的角色[1-2]。NPs结构中具有一个由两个Cys通过二硫键形成的17个氨基酸的环形结构域和两个游离的末端序列(CNP只有N末端)(附图)。研究表明，NPs的环状结构是其与相应受体结合而发挥舒张血管作用的重要活性中心，而两个游离的末端主要起排钠和利尿的作用[3]。本研究依据天然NPs的构效关系，将钠尿肽分子的N末端头部、二硫键连接的环状结构，以及C末端尾部进行组合设计，进而比较所获得新型钠尿肽分子的舒血管活性,旨在获得新型候选药物。

材料与方法

1 材 料 CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC、ANP、BNP和CNP均由江南大学医药学院提供。NE(去甲肾上腺素)和Ach(乙酰胆碱)系美国Sigma 公司产品。雄性SD大鼠(体质量250～350 g,6～8周龄)在室温为( 23±1 ) °C、相对湿度为60 %～70 %的环境下饲养，每天6:00至18:00给予光照。整个实验阶段,大鼠在标准的实验室清洁环境中饲养，并给予自由饮食饮水。

2 方 法 ①钠尿肽分子的人工设计与合成：依据天然NPs的构效关系，将钠尿肽分子的N末端头部、二硫键连接的环状结构，以及C末端尾部进行组合设计，确定新型钠尿肽分子的一级结构。采用固相化学法合成钠尿肽分子。②腹主动脉环制备及舒血管活性测定：正常SD大鼠5只经腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，剪取腹主动脉，置于盛有冷的Krebs 液(mmol/L:115 NaCl，4.7 KCl，25 NaHCO3，1.2 MgCl2,1.2 KH2PO4,2.5 CaCl2,10 %葡萄糖；pH 7.4)中,去掉血管表面结缔组织,制备成3 mm长的血管环。其中一半血管环用浸有对照液的棉花拭子轻轻摩擦内皮表面以去除内皮。将血管环悬挂于盛有37 °C Krebs液的浴槽中,通入含95 % O2和5 % CO2的混合气体[4],连接张力传感器。重复给予0.1 mol/L KCl,以每次100mg递增直至找到最佳基础张力为500mg,用于后面的药理学实验。经平衡30 min后,用Ach (10-6mol/L )对经过NE (10-6mol/L )预收缩的血管环是否产生舒张效应判断血管内皮活性。然后反复冲洗使血管张力恢复至基线,稳定30 min后重复给予NE (10-6mol/L ),使血管环收缩达稳定值(80 %最大收缩幅度),分别逐渐增加CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC、ANP、BNP和CNP的浓度(10-10～10-6mol/L)，以制作累积浓度-舒张反应曲线,求出最大舒张反应值(Emax)。

结 果

1 新型钠尿肽分子的获得 见附图，附表。钠尿肽家族(ANP、BNP、CNP、DNP和URO)的氨基酸序列及活性结共同点为：具有N端头部、二硫键连接的环状结构，以及C端的尾部。CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC均为嵌合体的钠尿肽分子，其中CNAAC和BNAAC以ANP的环状结构为核心，分别嵌合CNP的N端、BNP的N端以及ANP的C端。BNBAC、ANBAC和CNBAC以BNP的环状结构为核心，分别嵌合BNP的N端、ANP的N端、CNP的N端，以及ANP的C端。ANCAC、BNCAC以CNP的环状结构为核心，分别嵌合ANP的N端、BNP的N端，以及ANP的C端。CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC从结构上看，天然钠尿肽ANP、BNP、CNP是CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC的“双亲”，而CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC则是“兄弟”关系。考虑到CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC与天然钠尿肽结构上的相似性，我们进一步比较研究了CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC与ANP、BNP、CNP的舒血管活性。

附图 钠尿肽家族(ANP、BNP、CNP、DNP和URO)的氨基酸序列及活性结构示意图

附表 钠尿肽扩张血管活性的比较(n=5)

讨 论

目前，对NPs分子的改造主要集中在其尾部的重新组合上，已有血管钠肽(Vasonatrin peptide, VNP)、CD-NP、CU-NP、CUB-NP、CAA-NP、BUA-NP、BAA-NP等，均为采用天然NPs的环状头部和尾部重新组合而成，统称为嵌合体钠尿肽(chimeric/designer natriuretic peptide)[5-7]。这种改构模式是基于NPs的环形结构域和游离末端功能的独立性，以及互相之间对构象形成不干扰的假设下进行的，希望获得高生物活性的新NPs分子。

本研究根据天然钠尿肽分子的构效关系，采用“头”、“尾”和“环”组合的方式，设计合成了多种嵌合体钠尿肽分子。这些新钠尿肽分别包含其亲本的17个氨基酸组成的环结构及C末端和N末端。这些不同结构的嵌合体利尿钠肽钠尿肽实验结果说明：①NPs分子的环形结构域和游离末端在功能上虽有一定的独立性，但结构上存在互为影响的因素；②保留某一NPs成员的分子完整性再叠加尾部的基于功能结构域的设计方案是行之有效的。设计合成新型钠尿肽嵌合体，以优化钠尿肽结构对于钠尿肽的临床应用是可行的策略。

综上所述，作为新型人工合成的钠尿肽，CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC的舒血管效应提示他们可能成为治疗高血压的新型候选药物。目前，我们只对CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC的扩血管活性进行了比较检测，但其心肾活性及机制还有待于进一步研究。

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(收稿：2014-07-31)

致 作 者

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陕西医学、陕西中医杂志社

Artificial modification and vasorelaxing functional evaluation of natiuretic peptides

Central Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Medical University (Xi’an 710038)

Yu Jun Tie Ru Wang Jianbang et al

Objective：To modify the structure and evaluate the vasorelaxing function of natriuretic peptides. Methods：According to the structure-activity relationship of natural natriuretic peptides (NPs), 7 kinds of novel NPs (CNAAC、BNAAC、BNBAC、ANCAC、ANBAC、BNCAC、CNBAC) were artificially designed and engineered. Furthermore, perfusion experiments of in vitro blood vessels were performed to evaluate the vasorelaxing effects of these novel NPs, compared with the natural NPs including atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), and C type natriuretic peptide(CNP).Results：Vasorelaxing effects were ranked as: CNP>CNAAC>BNAAC>BNBAC>ANCAC>ANP>BNP>ANBAC>BNCAC>CNBAC.Conclusion：Innovative designed NPs have the activity of their parent molecules, and might be new candidate drugs against cardiovascular diseases.

Natriuretic peptides Molecular structure Combinatorial chemistry techniques Vasodilation

*国家自然科学基金项目(81270329,31271220,81300190,81470438)

陕西省自然科学基金项目(2010JM4050,2014JM4166)

▲通讯作者：第四军医大学生理学教研室

促尿钠排泄肽类 分子结构 组合化学技术 血管舒张

R914.4

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.003

国家新药创制重大科技专项(2009ZX09103-671)