荧光偏振检测西北地区宫颈病变组织中HPV感染分型的研究*

武警陕西省总队医院妇产科(西安710054)

刘征丽 张 菊△ 张 潍◇ 高艳娥◆

·临床研究·

荧光偏振检测西北地区宫颈病变组织中HPV感染分型的研究*

武警陕西省总队医院妇产科(西安710054)

刘征丽 张 菊△张 潍◇高艳娥◆

目的：分析西北地区宫颈疾病组织标本中感染HPV病毒型别的分布与患者疾病病程和年龄的关联性。方法：分别提取425例西北地区宫颈疾病组织DNA，GP5+/GP6+非对称扩增荧光偏振检测方法检测每例宫颈疾病标本组织 DNA的15种HPV型别,统计分析HPV型别检测结果。结果：425例CIN及宫颈癌组织标本中,417例检测出HPV感染,感染率为98%。其中HPV16型感染101例,HPV11型感染69例,HPV6型感染56例,HPV18型感染51例,多重HPV型别感染39例。CIN I级中,高危型HPV感染阳性率为27.3%,CIN II级中,高危型HPV感染阳性率为65.1%,CIN III级中,高危型HPV感染阳性率为65%；宫颈癌中,高危型HPV感染阳性率高达70%。CIN III级中,多重HPV感染阳性率为16.8%；宫颈癌中,多重HPV感染阳性率达16%。不同年龄组,低危型HPV检测阳性率差异较大。结论：本研究中,宫颈疾病标本中HPV感染率为98%，其中，高危型和多重感染在高CIN级别、宫颈癌及60岁以上组中的感染率呈上升趋势，提示HPV感染型别与病程和年龄有一定关联。

宫颈癌是目前世界上危害女性健康的第二大疾病,目前的研究已经证明,高危型人乳头瘤病毒(HPV) 持续感染是导致癌前病变,形成宫颈癌的主要致病因素。高达99.7%的宫颈癌组织中存在人乳头瘤病毒(HPV)感染。筛查和阻断HPV感染是目前宫颈癌早期预防的重要方向[1]。本研究应用荧光偏振技术检测并分析西安地区三所医院妇科经病理组织学检查确诊为宫颈癌和 CIN的患者组织标本中感染HPV病毒型别的分布及其与疾病进程、患者年龄关联性,研究HPV-DNA型和不同亚型复合感染在宫颈癌和CIN中的感染率,以分析本地区宫颈癌和宫颈病变中的优势感染型别,为指导西北地区宫颈癌的预防和个体化治疗提供思路和分子诊断方法。

材料与方法

1 对 象 2010年3月至2014年3月,就诊于第四军医大学西京医院、西安交通大学第二医院、武警陕西总队医院的425例宫颈癌和CIN患者,年龄19～68岁,宫颈癌患者51例,CIN患者374例,其中CIN I期56 例，CIN II期173例，CIN III期145例。所有患者均知情同意，并经过院伦理委员会批准。

2 仪器与试剂 荧光偏振检测仪Wallac Victor 1420 Multilabel Counter(Perkin Elmer),基因组DNA提取试剂盒,普通质粒小提试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs购自Progema；分别含HPV L1 区域的pGEM-T-HPV16、pGEM-T-HPV18、pGEM-T-HPV31、pGEM-T-HPV33、pGEM-T-HPV35、pGEM-T-HPV39、pGEM-T-HPV42、pGEM-T-HPV34、pGEM-T-HPV45、pGEM-T-HPV 51、pGEM-T-HPV56、pGEM-T-HPV58、pGEM-T-HPV52 质粒对照标准品由第四军医大学药学系全军基因诊断技术研究所提供[2]。

3 实验方法 ①DNA提取：每例患者宫颈标本均分成两部分：一部分用于病理组织学鉴定，另一部分用于分子生物学分析。后一部分组织 DNA 提取严格按照TIANamp Genomic DNA Kit 试剂盒说明书操作进行，产物经紫外分光光度计测量纯度和浓度后放置于-20℃保存。DNA溶于10μl Tris-HCl (1 mmol/L, pH 8.0)，存于-20℃，用于后续检验。②引物与探针：15种常见HPV型别：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 42、HPV 34、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56和HPV58是我国人群最常见的宫颈致病型别[3]。15型高危HPV通用引物和特异探针序列参照文献[3]，由上海生工生物工程有限公司合成。GP5+ 5‘-tttgttactgtggtagataccactc-3’，GP6+ 5‘-gaatatgatttacagtttatttttc-3’。③标本的HPV非对称扩增荧光偏振分型检测：以提取的宫颈CIN或宫颈癌组织DNA为模板，参照文献[2-3]，应用非对称扩增荧光偏振检测方法检测每例宫颈癌或CIN标本组织DNA的15种常见HPV型别：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 42、HPV 34、HPV 45、HPV 51、HPV 56、HPV58和HPV 52型。首先，GP5+/GP6+通用引物非对称扩增：反应体系(100μl): 模板DNA 10μl，3.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.01uM GP5+上游引物，0.1uM GP6+下游引物，2.0U Taq DNA聚合酶。反应条件为: 94℃预变性 5min，94℃ 60s，45℃ 60s，72℃ 60s，40循环，最后94℃ 60s，45℃ 60s。然后，20μl非对称扩增产物与每组中各1.8nM 3种型特异探针溶液250μl混合，48℃孵育30min，冷却至室温于荧光偏振检测仪检测每个反应的荧光偏振值。每例标本的非对称扩增产物共分5组行荧光偏振杂交分型检测。FAM (6-carboxy-fluorescein)检测的激发光波长485nm，吸收光波长530nm，TAMRA (tetramethyl-6-carboxyrhodamine)检测的激发光波长535nm，吸收光波长590nm，ROX (b-carboxy-x-rhodamine)检测的激发光波长580nm，吸收光波长620nm。将pGEM-T-HPV6、pGEM-T-HPV11、pGEM-T-HPV16、pGEM-T -HPV18、pGEM-T-HPV31、pGEM-T-HPV33、pGEM-T-HPV35、pGEM-T-HPV39、pGEM-T-HPV42、pGEM-T-HPV34、pGEM-T-HPV45、pGEM-T-HPV 51、pGEM-T-HPV56、pGEM-T-HPV58、pGEM-T-HPV52 质粒对照标准品和标本DNA分别按以上条件进行检测。每例均重复3次。检测分析FP值以确定样本的病毒型。

4 统计学分析 应用 SPSS17.0统计软件对实验结果进行分析，t检验分析相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HPV分型的荧光偏振检测结果 见表1。425例CIN及宫颈癌组织标本中，417例检测出HPV感染，感染率为98%。其中HPV16型感染101例,占24.2%,是本研究中感染率最高的一型,以下依次为HPV11型感染69例,占16.5%,HPV6型感染56例,占13.4%,HPV18型感染51例,占12.2%,多重HPV型别感染39例,占9.4 %。7例CIN及1例宫颈癌未检测出HPV感染。

2 高危HPV病毒型别与疾病进程关联性 见表1。各级CIN及宫颈癌中，高危型HPV感染阳性率为60.7%，多重HPV感染阳性率为9.4%。各级别CIN中,感染随CIN级别的增高,高危型HPV的感染率呈上升趋势,CINI级中,高危型HPV感染阳性率为27.3%,CINII级中,高危型HPV感染阳性率为65.1%,CINIII级中,高危型HPV感染阳性率为65%；宫颈癌中,高危型HPV感染阳性率高达70%。多重感染在高CIN级别及宫颈癌中的感染率也呈上升趋势,CINIII级中,多重HPV感染阳性率为16.8%；宫颈癌中,多重HPV感染阳性率达16%。56例低危型HPV6阳性患者中,CINI感染率占30.3%,宫颈癌感染率仅占7%；69例低危型HPV11阳性患者中,CINI感染率占33.3%,宫颈癌感染率仅占4.3%。

表1 HPV各病毒型别感染与宫颈病变病程[n(%)]

3 高危HPV病毒型别与患者年龄关联性 见表2。各年龄组中,17～40岁组,低危型HPV检测阳性率为35.2%；41～60岁组,低危型HPV检测阳性率为24.5%；60岁以上组,低危型HPV检测阳性率仅为11.9%,具有统计学差异(P<0.05),提示高危型HPV感染率随年龄增加有所提高。17～40岁组，复合感染HPV检测阳性率为10%，41～60岁组，复合感染HPV检测阳性率为7.9%，60岁以上组，复合感染HPV检测阳性率为9.5%，各年龄组间无显著差异(P>0.05)。

表2 HPV各病毒型别感染与患者年龄

讨 论

宫颈癌是危害女性健康的第二大常见肿瘤,是造成发展中国家女性死亡的主要病因[4]。宫颈癌发病原因复杂,潜伏期可长达10年之久,高危型HPV病毒持续感染是宫颈癌及癌前病变的致病因素,HPV病毒型众多,基因序列的复杂性决定了致病作用的复杂性,高危型HPV病毒的E6/E7癌基因表达,使宿主细胞生长调节失控,转化为永生细胞,在致癌因素的协同下导致癌变发生[5-7]。HPV基因型的检测既是预测妇女宫颈病变的风险标志物，也将是基于HPV基因型别不同而采用不同的针对性的免疫和放化疗治疗方法的基础，将对未来宫颈癌的阻断性干预预防和靶向治疗效果有重要影响。

本文研究西安地区确诊的宫颈癌和CIN患者中HPV DNA检出率为98%，其中，高危型HPV感染阳性率为60.7%,多重HPV感染阳性率为9.5%。我们发现：在本地区宫颈癌及癌前病变患者呈显著年轻化趋势,随病变恶性程度的增高,高危型HPV和多重HPV感染的感染率呈上升趋势,进一步证实了 HPV感染在宫颈病变发生发展中的重要作用。HPV基因型别的研究结果存在地域差异,在本地区HPV单一型感染中,以HPV11、16、18、52、58型感染率最高,其次是多重HPV感染,其中高危HPV 16感染率位居第一。本研究还将患者人群按年龄分为3组：19～40岁、41～60岁、60岁以上。60岁以上组,高危型和多重HPV检测阳性率达88.1%,具有统计学差异,提示高危型HPV感染率随年龄增加有显著提高,表明HPV感染各年龄段分布不同,年龄可能是影响HPV感染型的重要因素,高龄感染患者的癌变率可能更高。

积极推进宫颈HPV感染型筛查普及,掌握本地区优势感染型别,以便及早发现高危型HPV感染人群,及早治疗CIN患者，阻止HPV感染的传播,对于阻止宫颈癌的发生发展,降低本地区宫颈癌发病率和病死率有重要意义。本研究综合研究分析了西安地区宫颈癌中HPV感染分型及其与疾病病程和年龄的分布与关联性，提示了HPV感染型别与疾病病程和年龄的显著相关性,将为本地区宫颈疾病的防治、对病变患者针对性的实施阻断干预和靶向治疗、改善预后提供重要的临床依据,对于宫颈癌的预后分析和针对性、预见性个体化治疗也具有重要的指导意义。

[1] Huges C. Cervical cancer: prevention, diagnosis, treatment and nursing care[J]. Nurs Stand, 2009, 23(27)48-56.

[2] Ju Z, Zhongcan C, Yane G,etal. Anovel fluorescence polarization based assay for 14 human papillomavirusgenotypes in clinical samples[J].J Virol Meth,2006,134：223-229.

[3] Zhang J,Gao Y,Li D,etal. Asymmetric GP5+/6+ PCR and hybridization with fluorescence polarization assay of 15 human papillomavirus genotypes in clinical samples[J]. J Clinic Virol, 2009 (44)：106-110.

[4] 刘金风. 宫颈癌及高危型癌前病变HPV型别分布与多重感染[J]. 中国妇幼保健, 2010, 25：2208-2209.

[5] Karimi ZM, Behtash N, Chiti Z,etal. Cervical cancer and HPV vaccines in developing countries[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2009, 10(6)：969-974.

[6] 郝瑞凤, 王培玉. 宫颈癌流行病学及高危因素探讨[J]. 医学综述, 2009(10)：1495-1498.

[7] 曾 新,韩一栩,吴丽香.HPV在宫颈炎、宫颈癌前病变、宫颈癌中的检测意义分析[J].中国实验诊断学,2014(18)：127-128.

(收稿：2014-08-19)

The detection of human papillomavirus genotypes with fluorescence polarization assay in North-Western China’s Patients Cervical Tissue

The Armed Police Corps Hospital of Obstetrics and Gynecology in Shaanxi Province(Xi’an 710054)

Liu Zhengli Zhang Ju Zhang Wei et al

Objective：To detect HPV genotypes in cervical tissue samples and to investigate the relationships between HPV genotypes and the clinical stage, age of patients. Methods：15 HPV genotypes in 425 cervical cancer tissue samples were detected by GP5+/6+ PCR and hybridization with fluorescence polarization assay. HPV genes in samples were amplified by GP5+/6+ PCR. Fifteen HPV genotypic probes labeled with fluorophores hybridized with target PCR product to identify the presence of specific HPV genotypes. The relationships between HPV genotypes and the clinical stage, age of patients were analyzed by SPSS17.0 and t test. Results：417 of 425 cervical tissue samples were HPV positive. 101 cervical tissue samples were HPV16 positive. 69 cervical tissue samples were HPV11 positive. 56 cervical tissue samples were HPV6 positive. 51 cervical tissue samples were HPV18 positive. 39 cervical tissue samples were multiple-HPV positive. The infection rates of high-risk HPV were 65% and 70%in CINIII and cervical cancer respectively. The infection rates of multiple-HPV were 16.8% and 16% in CINIII and cervical cancer respectively. The infection rates of low-risk HPV were 35.2%，24.5% and 11.9% in 17-40years, 41-60 years and beyond 60 years group respectively. Conclusion：This study suggested a possible relationship between HPV infection and cervical disease. The infection rates of HPV are 98%. The infection rates of high-risk and multiple HPV increased in CINIII, cervical cancer and beyond 60 years group.

Uterine cervical neoplasms Papillomavirus infections Fluorescence polarization immunoassay

*国家自然科学基金项目(81071435，81371891)

△第四军医大学药学系基因诊断技术研究所

◇第四军医大学西京医院妇产科

◆西安交通大学医学院第二附属医院妇产科

子宫颈肿瘤 乳头状瘤病毒感染 荧光偏振免疫测定

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.012