3D-人造皮肤模型在化妆品安全性、功效性评价中的应用

张春晓+杜镇建+张兴民

人类皮肤覆盖于整个体表，被称为生命之裳，不仅因为皮肤保护我们的肌肉和内脏免受环境中有害物质的侵害，还源于它的重要审美价值。人类追寻美丽的步伐从未停止过，《齐民要术》里就有各种关于如何配制护肤品的记载。进入21世纪，随着我国人民生活水平的不断提高，化妆品已经成为人们的生活必需品。如何保障化妆品的安全性和功效性，是政府监管部门、化妆品公司和消费者共同关注的问题。

在过去的三十年，化妆品的安全性检测主要依靠动物试验，然而动物试验遭到动物保护组织的强烈反对。欧盟自2013年起，全面禁止出售和进口基于动物试验的化妆品或原料。化妆品的功效性检测一般是通过体外细胞试验实现，不过鉴于人体皮肤组织的复杂性，简单的体外细胞模型很难反应真实情况。

3D-人造皮肤模型为化妆品安全性、功效性评价提供了新的技术手段。3D-人造皮肤模型是将人的正常皮肤细胞培养于特殊的插入式培养皿上，得到具有三维结构的皮肤组织模型。如图1，其表面形成角质层暴露于空气中，可以将受试化妆品直接滴加在表面，模拟了将化妆品涂抹于局部皮肤表面的过程；基层细胞依靠底部培养基维持生长。3D-人造皮肤模型因为其组织结构和生理功能与正常皮肤组织十分相似，而成为良好的皮肤替代模型，并且在近年来被广泛应用。目前商品化的3D-人造皮肤模型可以分为3类：表皮模型、全皮模型和黑色素皮肤模型。本文针对这3种模型，简单介绍它们在化妆品安全性和功效性评价中的应用。

1 表皮模型

表皮模型顾名思义，与人类的表皮结构相似，仅由角质细胞构成，包括基底细胞层、棘细胞层、颗粒层和角质层。使用表皮模型替代动物试验，进行化妆品及其原料的腐蚀性、刺激性检验，已经得到欧洲替代方法研究中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）的认可，经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development， OECD）也颁布了相应的试验指南（OECD Testing Guideline 431&439）。另外，ECVAM正在审批使用表皮模型进行皮肤光毒性检测。

1.1 皮肤腐蚀性、刺激性检测

检测化妆品的皮肤毒性是安全性评价中的重要组成部分。将表皮模型用于皮肤腐蚀性、刺激性检测，能很好地模拟化妆品渗透皮肤进入机体进而产生毒性的过程，而且操作简便，只需将受试品滴加于模型表面，孵育相应时间，再使用MTT法检测细胞活率，即可将腐蚀性、刺激性这类描述性词语，转换为具体的数据进行判断。不仅保证了动物福利，而且过程更简捷，结果更准确。

1.2 皮肤光毒性检测

光毒性是指皮肤接触化学物质后，再与紫外线接触而产生的皮肤毒性反应。很多特殊用途化妆品，比如防晒霜，烫发、染发产品，它们的原料中都可能含有可产生光毒性的化学物质。使用表皮模型进行光毒性检测，其过程是先将受检物滴加于模型表面，然后暴露于一定照射剂量（通常为1.7 mW/cm2）的紫外线下一个小时，再使用MTT法检测细胞活率。

2 全皮模型

人类皮肤包括表皮、真皮和皮下组织三个部分。真皮层含有成纤维细胞和胶原纤维，成纤维细胞与表皮中的角质细胞相互作用，促进角质细胞分裂、分化；胶原纤维为皮肤提供弹性。全皮模型包括表皮与真皮两部分，表皮部分与表皮模型相似，真皮部分是由成纤维细胞和胶原基质组成。全皮模型在结构上与皮肤更相似，适合进行抗衰老、保湿等化妆品功效性研究。

2.1 抗衰老

抗衰老是国内外化妆品功效研究的热门课题。衰老的明显特征为皱纹产生和皮肤松弛，表现为表皮真皮连接处变平、弹性纤维和胶原纤维减少等情况。人类全基因组表达谱绘制的完成，帮助研究者鉴别出在皮肤老化过程中起关键作用的因子，如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和炎症介质等。使用全皮模型做为抗衰老评价的体外模型，其优势有两个：第一，全皮模型具有角质层，可以将化妆品涂抹在上面，模拟化妆品作用于皮肤局部的过程；第二，全皮模型具有活的角质细胞、成纤维细胞，其生理功能与真实皮肤组织中的细胞相似，因此可以检测抗衰老关键基因、蛋白的表达情况，从分子生物学角度评价化妆品的功效。

2.2 保湿作用

保湿是指通过使用相应化妆品维持肌肤，尤其是面部肌肤的含水量。保湿对于皮肤而言非常重要，因为皮肤与空气直接接触，水分非常容易流失。研究者发现人体皮肤中存在许多具有保湿作用的因子。如果在皮肤表面添加这些保湿因子，是否可以起到保湿作用呢？全皮模型为证明研究者的假设提供了有效的技术手段。

以透明质酸为例，研究者发现，透明质酸在表皮中负责保持皮肤的水分和弹性。随着年龄的增长，表皮中的透明质酸含量逐渐降低，进而皮肤平整度降低皱纹产生。N-乙酰-葡萄糖胺是透明质酸的前体物质，烟酰胺是透明质酸合成的重要协同因子。研究者将N-乙酰-葡萄糖胺和烟酰胺加至全皮模型表面一段时间后，检测发现透明质酸和胶原蛋白的基因表达与蛋白表达量均有上升，说明在皮肤表面施加N-乙酰-葡萄糖胺和烟酰胺，对于透明质酸的合成有促进作用。

3 黑色素皮肤模型

黑色素是人体皮肤的关键色素，主要功能是清除紫外线辐射给皮肤带来的伤害，但同时也带来肤色变暗、色斑生成等皮肤问题。皮肤美白是指通过使用特殊的化妆品抑制由紫外线照射所生成的黑色素，防止色斑的产生，恢复皮肤原本的色泽。这些化妆品中通常含有黑色素生成抑制剂，它们作用于黑色素形成的不同阶段，比如抑制黑色素细胞被紫外线激活，抑制酪氨酸酶活性或是抑制黑素体转移黑色素至角质细胞。无论是以何种原理或方式抑制黑色素生成，最终评价黑色素抑制剂是否有效，都需要测量黑色素含量。

黑色素由位于表皮基底层的黑色素细胞分泌。黑色素皮肤模型是在表皮模型的基础上，添加正常人类黑色素细胞。这些黑色素细胞同样位于表皮基底层，能够自发地产生黑色素，然后通过黑素体传递给相邻的角质细胞。因此可以利用黑色素模型评价化妆品对于黑色素的调节作用。

小结

传统的化妆品安全性，采用动物试验，例如向兔子的角膜滴加受试品，检测其刺激性。不仅结果不准确—因为兔子的角膜与人类皮肤有很大的差别，而且十分残忍，不符合动物福利。

化妆品功效性试验，多是采用体外细胞培养，比如使用小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）检测光毒性，或是使用小鼠黑色素瘤细胞（B16）检测黑色素抑制作用。这些体外试验虽然可以提供一些有帮助的数据，但也都存在很多问题。首先，它们均使用小鼠或其他动物的细胞，甚至于肿瘤细胞，与人正常表皮细胞的生理功能相差甚远；其次，这些体外试验的细胞均是浸没于培养基

中，实际上人类皮肤是暴露于空气中，因此将化妆品加入到细胞培养液中，与将它们涂抹于皮肤表面之间存在明显的差异；再次，化妆品的功效性评价一直存在主观性过强的问题，因为像皱纹数量是否减少，皮肤含水量是否增多，皮肤是否变白，都是依靠人的肉眼观察，然后进行判断，这样难免会见仁见智，出现偏差。

3D-人造皮肤模型利用特殊的气液面培养方式，得到具有角质层的多层细胞组织结构，既可以模拟化妆品加于皮肤上的真实状况，又可以将主观判定的功效转变为具体数据输出，为化妆品功效性评价提供一个更加客观、科学和准确的评价模型。endprint