广藿香不同组织总RNA提取方法的筛选与优化

陈英　吴友根　杨东梅　张军锋　林尤奋　胡新文

摘要：分别采用Trizol法、改良Trizol法、CTAB法、改良CTAB法和异硫氰酸胍-SDS法等5种方法提取广藿香叶、茎、根及愈伤组织的总RNA，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱检测其提取效果。结果表明，Trizol法适用于广藿香叶片总RNA的提取，改良CTAB法适用于广藿香茎和愈伤组织总RNA的提取，而广藿香根总RNA的提取宜用改良Trizol法。RT-CR检测结果表明，广藿香各组织的总RNA可直接用于分子克隆和基因表达分析等分子生物学试验。

关键词：广藿香；总RNA；提取方法；Trizol法；CTAB法；异硫氰酸胍-SDS法

中图分类号：Q522文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-0053-03

广藿香[ogostemon cablin （Blanco） Benth]为唇形科刺蕊草属植物，原产于东南亚地区如马来西亚、菲律宾、印度尼西亚等国，在我国引种可追溯到梁代或以前。我国主要栽培地为海南和广东2省，广西、福建及台湾等地也有少量栽培。广藿香以干燥地上部分入药，是我国常用的芳香化湿类中药之一，常用于治疗湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿倦怠、胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛等疾[2]。广藿香不仅是30多种中成药的主要原料，而且以其提取的广藿香油还是医药和轻化工业的重要原料[3]。从植物组织中提取完整性好、纯度高的RNA，是开展植物分子生物学研究的前提和基础，是研究基因克隆及表达分析的重要环节[4]。但广藿香各组织总RNA提取方法尚鲜见报道，且广藿香富含多糖等次生代谢产物[5]，对总RNA提取的影响较大。本研究以广藿香叶、茎、根及愈伤组织为试验材料，对比Trizol法、改良Trizol法、CTAB法、改良CTAB法和异硫氰酸胍-SDS法等5种方法的提取效果，以期筛选广藿香各组织总RNA提取的方法，为广藿香的分子生物学研究奠定基础。

材料与方法

材料与试剂

供试的广藿香植物材料采于海南大学园艺园林学院广藿香资源圃，采集生长期为4个月的广藿香叶、茎、根，采后用液氮冷冻处理，-70 ℃保存，备用。供试的广藿香愈伤组织由广藿香叶诱导，取生长旺盛的愈伤组织作RNA提取的材料。

试验所用的主要试剂有Trizol（Invitrogen公司）、DEC（Sigma公司）、反转录试剂盒（Fermentas公司）、SDS、CTAB、异硫氰酸胍（北京鼎国公司），其余试剂均为进口或国产分析纯，引物由北京诺赛基因组研究有限公司合成。试验中所用枪头、CR管、离心管等塑料耗材均用0% DEC水浸泡处理过夜，并于2 ℃ 下高压灭菌20 min，烘干，备用；用于RNA提取的研钵、玻璃器皿均在80 ℃下烘烤6～8 h，备用。

2方法

2 RNA提取方法采用传统Trizol法[6]、改良Trizol法[6]、传统CTAB法[7]、改良CTAB法[8]和异硫氰酸胍-SDS法[9]。

22 RNA质量与浓度检测取5 μL提取的广藿香各组织总RNA溶液于2%琼脂糖凝胶在×TBE缓冲液中电泳，检测RNA的完整性。并取 μL RNA样品，用DEC处理水稀释50倍，用紫外分光光度计检测D260 nm、D280 nm，并计算D260 nm/D280 nm，以确定其纯度及得率。

23 RT-CR分析 反转录参照Fermentas反转录试剂盒说明书进行。通过RT-CR扩增看家基因GADH基因，CR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳检测目的条带。上游引物为5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′；下游引物为5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。CR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃终延伸7 min，4 ℃保存。

2结果与分析

2广藿香各组织总RNA完整性的检测

由图可知，5种方法均能从广藿香叶中获得RNA，且用这5种方法所得RNA的28S、8S、5S等3条条带都较清晰，说明质量较好，但以Trizol法所得RNA效果最好，表现为28S条带的亮度约为8S的2倍，说明杂质含量较少。除Trizol法外，其余4种方法均能从广藿香茎中获得RNA，但除改良CTAB法以外，其他3种方法获得的RNA均有DNA污染，且改良Trizol法和异硫氰酸胍-SDS法所得RNA条带较模糊，说明存在轻度降解。5种方法均能从广藿香根中获得RNA，且用这5种方法所得RNA的28S、8S、5S等3条条带都较清晰，但Trizol法所得RNA条带较暗，说明得率较低，改良CTAB法所得RNA 5S条带较亮，说明存在降解，CTAB法和异硫氰酸胍-SDS法所得RNA存在DNA污染，改良Trizol法所得RNA条带清晰，虽亮度不及除Trizol法外的其他3种方法，但无DNA污染。5种方法均能从广藿香愈伤组织中获得RNA，但Trizol法和改良Trizol法所得RNA条带模糊，说明存在降解，CTAB法所得RNA条带亮度较暗，说明得率较低，改良CTAB法和异硫氰酸胍-SDS法所得RNA 条带清晰，亮度适中，说明质量较好。[FL）]

[FK（W6][TWYGtif][FK）]

[FL（2K2]22广藿香各组织总RNA的纯度和产率

由表可知，5种方法从广藿香叶中所得RNA的 D260 nm/D280 nm 的值均大于8，说明RNA的纯度较高，样品中存在的多糖、多酚或蛋白等杂质较少，其中Trizol法和CTAB法所得RNA的D260 nm/D280 nm 的值较大，分别为99、20，但Trizol法所得RNA的产率较CTAB法大。除Trizol法未能从广藿香茎中提取出RNA外，其余4种方法从茎中所得RNA的D260 nm/D280 nm 的值均大于8，但以改良Trizol法最高，为88，且其得率最高，为2720 μg/g。除改良CTAB法外，其余4种方法从广藿香根中所得RNA的D260 nm/D280 nm 的值均大于8，改良CTAB法为76，说明RNA样品中存在蛋白或其他有机物的污染，RNA得率以CTAB法最高，为33920 μg/g。改良CTAB法和异硫氰酸胍-SDS法从广藿香愈伤组织中所得RNA的D260 nm/D280 nm 的值大于8，得率以改良CTAB法较高，这可能是由于异硫氰酸胍-SDS法沉淀次数较多，虽然使得多糖、蛋白等杂质得以沉淀，但同时也使部分RNA一同被沉淀下来，因此RNA的产率偏低。[FL）]

[FK（W9][HT6H][Z][WTHZ]表不同方法提取的广藿香叶、茎、根及愈伤组织总RNA的纯度及产率[HTSS][STBZ][WTBZ]

[H5][BG（！][BHDFG3，WK8，WK52W]提取方法[ZB（][BHDWG2，WK26。2W]D260 nm/D280 nm 的值总RNA产率（μg/g）

[BHDWG2，WK62。8W][XXZSX2-ZSX252]叶茎根愈伤组织[XXZSX2-ZSX252]叶茎根愈伤组织[ZB）W]

[BHDG2，WK8ZQ2，WK62。8W]Trizol法99— 847628400— 400022640

[BHDW]改良Trizol法8288 8479286402720987024960

[BH]CTAB法2088273 2604023040 339208770

[BH]改良CTAB法80 84 76 84340087603384026920

[BH]异硫氰酸胍-SDS法8883 884 24520245403048025200[H][BG）F]

注：“—”表示未得到RNA，说明该法不适宜。[FK）]

[FL（2K2]23 RT-CR扩增结果

为了验证从广藿香不同组织中获得的总RNA的质量，对Trizol法提取的广藿香叶、改良CTAB法提取的广藿香茎和愈伤组织及改良Trizol法提取的广藿香根的总RNA反转录后，通过RT-CR扩增看家基因GADH基因，获得496 bp的特异目的条带（图2），与预期目的基因片段大小一致，条带明亮清晰，说明从广藿香叶、茎、根、愈伤组织所提取的总RNA样品质量好，能够用于后期的分子生物学试验。

3结论与讨论

目前，从植物中提取RNA有多种方法[0-7]，不同物种或同种植物不同器官或组织的最佳提取方法存在差异。为确保获得高质量的RNA并达到在相关研究中的要求，有必要针对

[FK（W3][TWYG2tif；S2mm][FK）]

广藿香不同器官或组织筛选出最佳RNA提取方法。蛋白质、多糖和酚类物质的污染是影响RNA提取质量的重要因素[8]。因为多酚氧化酶和RNase均为蛋白质；多糖的许多理化性质与RNA相似，在提取过程中很难将其与RNA分开，去除多糖的同时RNA也会被除去，从而导致RNA产量减少；酚类物质经磨样处理后会释放出来，易氧化褐变，被氧化后的酚类物质与RNA结合，使RNA丧失活性。广藿香不同组织或器官中多酚、多糖、蛋白质和水分含量与样品得率均不完全相同，这些对广藿香不同组织或器官中RNA的提取均有不同程度的影响。

对本研究所用的5种RNA提取方法进行比较后发现，Trizol法提取RNA操作简便，只需～2 h，其在茶树、甜瓜、芒果等许多植物RNA提取中都取得了良好的效果[9-20]。但笔者发现这种方法只有在广藿香叶中提取到的RNA质量较好，而在其他组织中提取的RNA质量较其他方法差，甚至提取不到RNA。这可能主要是因为该提取方法操作过于简单，无法有效地去除蛋白质等杂质。改良Trizol法中加入了强还原剂β-巯基乙醇，有效地抑制了酚类物质的氧化，同时还加入了络合物V，使其与酚类物质形成螯合物，从而有效去除酚类物质。该方法在三色堇、香蕉等多种植物RNA提取中都取得了良好的效果[8]，但本研究结果表明其在广藿香茎和愈伤组织中提取的RNA均存在轻微的降解现象，可能是由材料本身的原因造成的。CTAB不仅对植物细胞具有较好的裂解作用，而且还能有效分离核蛋白与核酸的复合物，同时和巯基乙醇联合作用变性蛋白，从而有效抑制RNA酶活性。用CTAB作为阳离子表面活性剂成分已从葡萄、苹果、棉花、瓜叶菊、矮牵牛等多种植物中分离出高质量的RNA[2-22]。本试验所用的改良CTAB法对广藿香茎和愈伤组织RNA的提取效果均优于其他几种方法。异硫氰酸胍和SDS均为强蛋白变性剂，能有效钝化RNase[23]，异硫氰酸胍-SDS法在一些内源RNase较活跃的RNA提取中取得了良好的效果[9]。但本研究结果表明，其对于广藿香的4种组织均不是最佳的提取方法，原因是不能有效地去除DNA污染，还需后续的RNA纯化步骤，这使得后续试验复杂化。是否存在蛋白质、多糖等杂质，DNA污染情况及得率高低是判别RNA质量好坏的重要指标。综合以上3个指标，本研究结果表明，Trizol法是从广藿香叶中提取总RNA的最佳选择，从广藿香茎和愈伤组织中提取总RNA适宜选择改良CTAB法，而要从广藿香根中获得RNA，则改良Trizol法较好。本研究结果还进一步说明了同一种植物的不同器官和组织，其RNA提取的最适宜方法存在差异。

[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]

[ZK（#]吴友根，郭巧生，郑焕强 广藿香本草及引种历史考证的研究 中国中药杂志，2007，32（20）：24-27，28

[2]国家药典委员会 中华人民共和国药典：一部[M] 北京：中国医药科学技术出版社，200：42[H7mm]

[3]Wu Y G，Guo Q S，He C，et al Genetic diversity analysis among and within populations of ogostemon cablin from China with ISSR and SRA markers Biochemical Systematics and Ecology，200，38（）：63-72

[4]张玉刚，成建红，韩振海，等 小金海棠总RNA提取方法比较及cDNA的LD-CR扩增 生物技术通报，2005（4）：50-53

[5]乌兰格日乐，白海泉，翁慧，等 广藿香多糖的优化提取工艺及抗氧化作用 中成药，200，32（7）：246-248

[6]孙德权，郭启高，胡玉林，等 改良Trizol法提取香蕉叶片总RNA 广东农业科学，2009（5）：62-64

[7]尹慧，陈莉，李晓艳，等 百合叶片总RNA提取方法比较及优化 中国农业大学学报，2008，3（4）：4-45

[8]赵巍巍，宗成文，曹后男，等 葡萄花序总RNA提取方法研究 安徽农业科学，2009，37（32）：66-662，676

[9]高志晖，魏建和，熊换英，等 几种提取白木香茎干总RNA方法的比较 生物技术通讯，202，5（5）：78-72[ZK）]

[0][ZK（#]Yamaguchi H，Hasegawa K，Esumi M rotein from the fraction remaining after RNA extraction is useful for proteomics but care must be exercised in its application Experimental and Molecular athology，203，95（）：46-50

狄建军，张庆波，孙颖飞，等 蓖麻种子总RNA提取方法比较 江苏农业科学，203，4（5）：33-34

[2]Djami-Tchatchou A T，Straker C The isolation of high quality RNA from the fruit of avocado （ersea americana Mill） South African ournal of Botany，202，78：44-46

[3]陈宏伟，万里红，杨进军，等 盐肤木叶片总RNA提取方法的比较研究 江苏农业科学，202，40（5）：27-30

[4]Bianchi S， Vecchio A， Vilarino M A Evaluation of different RNA-extraction kits for sensitive detection of hepatitis a virus in strawberry samples Food Microbiology，20，28（）：38-42

[5]王伟，李立芹，邹雪，等 马铃薯块茎总RNA提取方法比较 江苏农业科学，203，4（）：38-40

[6]Niu Y Y，Luo H M，Sun C，et al Expression profiling of the triterpene saponin biosynthesis genes FS，SS，SE，and DS in the medicinal plant anax notoginseng Gene，204，533（）：295-303

[7]Teixeira ，Fidalgo F Salt stress affects glutamine synthetase activity and mRNA accumulation on potato plants in an organ-dependent manner lant hysiology and Biochemistry，2009，47（9）：807-83

[8]李琴，王健，赵钟鑫，等 三色堇花瓣总RNA 3种提取方法的比较 江苏农业科学，203，4（5）：24-26

[9]赵继荣，毕阳，刘红霞，等 Trizol法提取厚皮甜瓜果实RNA条件的筛选 甘肃农业大学学报，2009，44（2）：56-59

[20]林金科，开国银 茶树RNA的提纯与鉴定 福建农业大学学报，2003，32（）：70-73

[2]胡根海，喻树迅 利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA 棉花学报，2007，9（）：69-70

[22]孟丽，周琳，张明姝，等 一种有效的花瓣总RNA的提取方法 生物技术，2006，6（）：38-40

[23]杨云，张争，孟慧，等 濒危南药白木香愈伤组织总RNA提取方法研究 广东农业科学，200，37（3）：93-95