甲壳动物、昆虫、真菌中甲壳素的提取进展

李彦艳，张闪闪，任国栋

（河北大学生命科学学院，河北保定071002）

甲壳动物、昆虫、真菌中甲壳素的提取进展

李彦艳，张闪闪，任国栋

（河北大学生命科学学院，河北保定071002）

甲壳素/壳聚糖是一种应用广泛可降解高分子材料，广泛存在于虾蟹壳、昆虫外骨骼、真菌细胞壁。随着甲壳素在医学、食品等方面的研究，甲壳素越来越受到国内外研究者重视。传统生产甲壳素的方法是利用虾蟹壳作为原料，虾蟹壳中甲壳素含量为20%～30%，方法主要包括传统的化学酸碱法，EDTA法及最近几年发展的酶法等。近年来资源昆虫和真菌成为研究开发的重点。从昆虫中提取甲壳素多采用酸碱法，但又不同于从虾蟹中提取方法。在真菌中，甲壳素和壳聚糖相互紧密交织存在于细胞壁中，通常以虾蟹壳中用酸碱法提取甲壳素的方法为基础，作一些改进。针对甲壳素来源不同的特点，介绍了制备甲壳素的不同工艺，为综合开发利用资源提供了参考。

甲壳素；壳聚糖；甲壳动物；昆虫；真菌

甲壳素，又名几丁质、甲壳质，是N-乙酰氨基葡萄糖经过β-1，4糖苷键连接的直链多糖，是自然界中储存量仅次于纤维素的第二大天然多糖，壳聚糖是甲壳素脱乙酰基而得。壳聚糖具有无毒，可生物降解，生物粘附性，并具有抑菌、抗肿瘤等活性，因此广泛应用于农业、食品、医药、生物工程等领域。

自然界中甲壳素来源广泛，存在于甲壳动物外壳、昆虫体壁和真菌细胞壁中。甲壳动物外壳含有大量的甲壳素，虾蟹壳中含量达10%～30%。虾蟹壳因为其稳定的来源，一直是生产甲壳素的主要原料。我国虾蟹壳年产量在1000多万t左右，甲壳素产量超3万t。从虾蟹壳里制备甲壳素的传统方法是酸碱法，一般有酸浸脱盐（主要为钙盐）、碱煮脱蛋白和氧化脱色三步[1]。目前，国内大都采用虾、蟹壳作为原料制备壳聚糖，但由于其来源有限、壳聚糖含量低、灰分含量高，提取成本相对较高，使其应用受到一定限制。昆虫中甲壳素含量可达20%～60%，已经有许多昆虫被我们利用，如蝉蜕、蝇蛆、蚕蛹、蜜蜂等。甲壳素存在于昆虫的体壁，而昆虫的体壁形成是骨化过程，不同于虾蟹的钙化过程，体壁中只含有少量无机盐，这使从昆虫中制备甲壳素相对简单。而且昆虫易于实现人工养殖，不受季节和环境的限制。另一类可供人类使用的资源就是真菌，甲壳素是绝大多数真菌细胞壁的组成成分，含量不一，有的高达45%。甲壳素和壳聚糖相互紧密交织存在于细胞壁中，通常采用稀碱除去菌丝表面的蛋白质等物质，将含有甲壳素和壳聚糖的细胞壁暴露出来，再用酸浸和碱沉淀即可得到甲壳素和壳聚糖。目前关于甲壳素提取的研究已有很多，但是要想更好应用这种材料，提取和制备品质优良的甲壳素/壳聚糖成为研究的首要问题。本文对不同来源的甲壳素制备工艺和方法作一综述。

1 甲壳动物的甲壳素

这里所说的甲壳动物主要指虾和蟹类。虾蟹壳中甲壳素含量为10%～30%，无机物（碳酸钙为主）含量为40%，其他有机物（主要是蛋白质）含量为30%左右[2]。

1.1 酸碱法

何明等[3]以小龙虾壳和北极虾壳为原料制备了甲壳素与壳聚糖。采用同样的方法：虾壳收集，处理干净；2 mol/L盐酸浸泡脱钙；10%NaOH煮沸除蛋白质；40%NaOH煮沸脱去部分乙酰基，制得壳聚糖。以小龙虾壳为原料，甲壳素的产率为15.92%，壳聚糖的产率为10.84%；以北极虾壳为原料，甲壳素的产率为17.25%，壳聚糖的产率为11.78%。

传统酸碱法使用大量的酸碱，不仅消耗能源，还造成环境污染，在此基础上对其改进显得刻不容缓。朱凯等[4]先将原料粉碎，用复合脱脂剂脱脂，再经过酸浸、碱煮等，降低了酸碱的用量，也提高了甲壳素产品的质量。周宏亮[5]以南极磷虾为原料，改变酸碱浓度和处理时间，制备了灰分含量较低的甲壳素。刘芳等[6]对对虾加工副产品的综合利用进行了初步探讨，建立了一整套虾头、壳综合利用工艺，最终获取率甲壳素为24%，壳聚糖22%，氨基葡萄糖盐酸盐13%，还得到43%碳酸钙，4.4%蛋白粉。杨丹等[7]采用EDTA代替盐酸从虾蛄壳制备了甲壳素，产率达24.83%，甲壳素的脱乙酰度为31.17%，相对分子质量为1.76×106。

1.2 酶法

杨锡洪等[8]探索以虾头制备壳聚糖的新工艺，采用紫外照射激活虾头内的自溶酶，利用酶水解脱除蛋白质替代传统碱加热处理法。Y.Xu等[9]以Penaeusmonodon和Crangon crangon shells为原料，采用发酵法制备甲壳素。厌氧细菌HP1产生的蛋白酶可除去蛋白；Lactobacillus caseiMRS1分解葡萄糖产生乳酸可脱除钙盐。经过生物降解，蛋白质含量分别由30%和10%降为5.8%和6.7%，而钙含量由12%和18%降为0.4%和0.3%，甲壳素的产率为37%、30%，黏度为0.045Pa·s、0.135Pa·s。W.J.Jung等[10]也尝试了用酶解法制备甲壳素和壳聚糖。利用Lactobacillus paracasei subsp.toleransKCTC-3074（L.3074）产生的乳酸除去蟹壳中的钙盐，Serratiamarcescens FS-3（FS-3）产生的蛋白酶除去蛋白质。蟹壳中灰分含量从41.16%降到1.15%，蛋白质含量由22.36%降到10.62%。

在制备低分子量的甲壳素和壳聚糖及其衍生物时，也常采用酶解法。Kwang Kim等[11]诱导Streptomyces griseus HUT 6037产生甲壳素酶和壳聚糖酶。可溶性壳聚糖（脱乙酰度为53%）可诱导甲壳质酶和壳聚糖酶[12]。利用此酶可制备低分子量的壳聚糖，在食品与医药领域有着更为广泛的应用。K.Kadokura等[13]培养Vibrio parahaemolyticus诱导其产生甲壳质酶和甲壳素寡糖脱乙酰酶，可降解甲壳素和N-乙酰氨基葡萄六糖得到N-乙酰氨基葡萄二糖，N-乙酰氨基葡萄二糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位；是合成双歧因子的重要前体；在临床上治疗风湿性及类风湿性关节炎；也可作为食品抗氧化剂及婴幼儿食品添加剂。

我国虾蟹的年产量达5 000万t，虾蟹壳年产量在1 000多万t左右，对于水产加工来说，虾蟹壳是固体废弃物，而对于甲壳素生产它则是很好的原料。虾蟹壳中的甲壳素含量较高，从虾蟹壳中制备甲壳素，不仅处理了废弃资源，还变废为宝。我国早在20世纪80年代初就提出了虾蟹壳的资源化处理法，经过多年的实践，在酸碱法基础上不断对工艺进行优化，具备了一定的技术基础，为实现产业化铺平了道路。但也存在许多难题。一方面，传统的化学酸碱法制备甲壳素造成能源浪费和环境污染，有价值的蛋白质遭受破坏不能作为资源而利用。虽然采用了一些比较温和的工艺（如酶法），但还不太成熟。另一方面，虾蟹壳含钙量高，给提取造成困难，且由于制备方法和所用原料不同，得到的甲壳素样品的溶解性、分子质量、脱乙酰度及黏度会有所不同[14]，产品的均一性差。

2 昆虫的甲壳素

另一大类节肢动物主要就是昆虫了，包括蝉蜕、蝇蛆、蜜蜂、蚕蛹等。昆虫甲壳素的提取方法归纳起来为“四脱”，一脱蛋白质，二脱脂肪，三脱无机盐，四脱色素。

2.1 从蝉蜕提取甲壳素

蝉蜕中的无机组分主要为碳酸钙，有机组分为蛋白质、甲壳素及少量的色素，甲壳素的含量为10%～12%[15]。制备甲壳素的传统方法是利用稀盐酸脱钙，碱煮脱蛋白，高锰酸钾脱色。

鄢立刚等[16]采用酸碱法从蝉蜕中提取甲壳素，产率为34.3%，远高于虾蟹壳。经过虾蟹壳甲壳素与蝉蜕甲壳素的质量对比分析，二者基本一致，分子中每结构单元含有1/2分子缔合水，维持了甲壳素的天然特性。

2.2 从蝇蛆提取甲壳素

在自然界中，苍蝇的繁殖能力位居第一，一对苍蝇4个月可繁殖2660亿个蝇蛆。干蛆含甲壳质30%～ 54.8%，高于虾蟹中甲壳素的含量，蝇蛆成为资源昆虫研究的重要方向之一。

以蝇蛆为原料制备甲壳素及其衍生物大多采用酸碱法。用虾蟹为原料可制备高、中、低不同黏度的壳聚糖，而用蝇蛆为原料制备的是中、低黏度的壳聚糖。且蝇蛆壳聚糖在低重金属离子含量、低灰分含量方面优于虾蟹壳聚糖。我国拥有长达1.8万公里的海岸线，沿海盐场较多。在制盐过程中，卤蝇在盐池中产卵、繁殖，大量的卤蝇蛆壳漂浮于盐池中，对制盐业造成危害。王稳航等对[17]卤蝇蛆壳进行综合利用，制备了质量较高的壳聚糖，成品为白色，脱乙酰度为78.90%，黏度为1.12 Pa·s。

2.3 从蜜蜂提取甲壳素

S.V.Nemtsev等[18]研究以蜜蜂为原料制备甲壳素。蜜蜂中含有35%～45%蛋白质，23%～32%甲壳素，2%～3%无机化合物。采用酸碱法除去蛋白和钙盐，用H2O275℃脱色1 h可得甲壳素；将甲壳素在50% NaOH碱煮可得壳聚糖。壳聚糖的产率为16%～25%，脱乙酰度为75%～84%，黏度为3Pa·s～4.5Pa·s。

2.4 从其他昆虫提取甲壳素

朱洪红等[19]利用家蚕蛹皮制备甲壳素，以酸碱法为基础，85℃下10%H2O2脱色0.5 h。甲壳素提取率为32%，灰分含量为0.63%～0.81%。产品质量指标达到食品级标准。

郭宝华等[20]以蝉蜕、喙尾琵琶甲、中华稻蝗为原料制备甲壳素。80℃下碱脱蛋白，酸脱钙盐，蝉蜕甲壳素收率36.23%，灰分含量0.68%，氮含量5.95%；喙尾琵琶甲甲壳素收率22.56%，灰分含量0.15%，氮含量5.54%；中华稻蝗甲壳素收率9.72%，灰分含量0.28%，氮含量5.79%。结果表明：以体壁角质化程度较高的蝉蜕和喙尾琵琶甲为原料提取甲壳素得率高，而以体壁角质化程度较低的中华稻蝗为原料提取甲壳素得率较低。因此在选择原料时，应尽量选择体壁角质化程度较高的昆虫。

利用昆虫来制备甲壳素和壳聚糖虽然报道较少，但很有开发价值。首先，昆虫种类多，许多昆虫都可以用作原料。全世界的昆虫大约有1 000万种，约占地球所有生物物种的一半，已定名的昆虫种类有100万种。其次，昆虫繁殖较快，易于实现人工养殖，不受季节、地域和资源的限制。最后，昆虫体壁中的甲壳素含量可达20%～60%，且昆虫体壁蛋白质含量较高，无机盐含量较低，可先用NaOH脱除蛋白质，再用HCl脱除无机盐，以节约盐酸的用量。这有利于制备灰分含量低的甲壳素，还可得到蛋白质资源。

3 真菌中的甲壳素

从20世纪80年代后期，日本和美国先后开始研究用微生物发酵的方法生产壳聚糖。C.C.LIN等[21]早在1970年就以Apodachlyasp.为研究对象观察了细胞壁的组成，用物理化学分离方法从中提取了甲壳素，经过X-Ray衍射分析，与甲壳动物甲壳素相比较差别不大。

用丝状真菌生产甲壳素/壳聚糖有很多优点：原料来源丰富，不受季节、地点及资源的限制，可大规模生产；制备工艺简单，甲壳素和壳聚糖相互紧密交织存在于真菌的细胞壁中，只需以虾蟹壳中用酸碱法提取甲壳素的方法为基础，作一些改进。首先用稀碱除去菌丝表面的蛋白质等物质，将含有甲壳素和壳聚糖的细胞壁暴露出来，再用酸浸和碱沉淀即可得到壳聚糖，最后存在于细胞壁中的甲壳质经过浓碱脱乙酰基变成壳聚糖，用酸浸和碱沉淀可得壳聚糖。

3.1 不同的培养基会影响菌体生长量和甲壳素的产量

贺淹才等[22]研究了黑曲霉在不同培养基中的菌体生长量，结果表明，黑曲霉在查氏、沙氏培养液中的培养量相差不大，菌体生长速度差不多，而YEPD培养液中菌体生长速度是前两者的20倍，其培养量也最大。他们依据电解法将几丁质和蛋白质分离，甲壳素提取的得率占干菌重量的20.6%。

王传芬等[23]也对用黑曲霉发酵法生产壳聚糖的培养基及工艺条件进行了研究。确定了其最佳培养基和最佳发酵条件，在此条件下壳聚糖得率为11.17%。

3.2 不同的真菌也会影响菌体生长量和甲壳素的产量

王荣等[24]选用总状毛霉和根霉在相同的培养条件下进行研究，菌丝的生长速度和产量相差不大，但总状毛霉的壳聚糖产率为17.6%，根霉的壳聚糖产率为12.5%。

陈忻等[25]早在1997年就对不同菌种生产壳聚糖的情况进行了比较，毛霉属的菌种壳聚糖产率高，质量好，纯度高，尤其是雅致放射毛霉在22℃～28℃培养45 h最高产率达1.26×10-2干重/L培养液。雅致放射毛霉是一个很有发展前景的菌种。

P.KOPECEK等[26]研究了3种菌株的甲壳素含量。Basidiobolus ranarum strain CCM 8151菌丝顶点部位甲壳素含量为3.45%，末端为5.20%，Neurospora crassa strain CCM 8041菌丝顶点部位甲壳素含量为2.01%，末端为4.04%，Coprinus sterquilinus strain CCBAS 360顶点部位甲壳素含量为1.34%，末端为5.85%。

3.3 不同的真菌制备甲壳素的方法是不同的

黑曲霉细胞壁中含几丁质和蛋白质，蛋白质具有可电离的基团，在溶液中能形成带电荷的阳离子和阴离子，在电场中向一方迁移，故可用电解法[27]制备甲壳素。

米根霉的细胞壁含有天然壳聚糖，可通过发酵法直接进行提取，不需经浓碱脱乙酰步骤，这不仅减少了碱的用量，还可提高企业的经济效益。

蓝色犁头霉的细胞壁也含有天然壳聚糖，产量占菌丝干重的11.72%。可直接从废菌体中提取脱乙酰度较高的壳聚糖。其他一些含有天然壳聚糖的菌种有木霉、五通桥毛霉、高大毛霉、华根霉等。

刘桦等[28]将日本根霉发酵培养得到菌丝体。121℃干燥、粉碎后获得黄褐色的菌丝体粉末。通过茚三酮法测定壳聚糖质量分数为10.22%。

HELENY.LEE等[29]培养Apodaehlya sp.47-17，从菌丝体中分离细胞，提取甲壳素，经化学成分分析，样品中含葡聚糖39%，甲壳素60%，蛋白质0.1%。

陈雪梅等[30]从柠檬酸发酵厂废黑曲霉菌丝体中提取甲壳素，不仅可降低壳聚糖的成本，而且为综合利用发酵废渣提供了一条新途径。经性能检测证明从柠檬酸厂的废黑曲霉菌丝体中提取得到的是白色颗粒状晶体的壳聚糖，其得率为7.2%。

4 讨论

甲壳素是一种天然高分子化合物，又被称为动物纤维素，是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以β（1→4）糖苷键连接的乙酰氨基葡萄糖。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，有很好的吸附性、成膜性和通透性、成纤性、吸湿性和保湿性，在工业、纺织业、化妆品行业、医药卫生领域及生物医学材料领域有重要的应用。甲壳素的制备工艺很多，根据不同的原料采用不同的制备方法，目前主要从虾蟹、昆虫和真菌中提取。从虾蟹中制备甲壳素的实例最多，但随着能源危机和环境污染加重，这种传统工艺需要改进，不少大专院校和科研单位开发了许多新方法，运用资源化处理法、酶法等新工艺，取得了很大进展。昆虫作为一种资源走上历史舞台，显示了巨大的应用价值。以昆虫作为原料制备甲壳素，还可得到丰富的蛋白质、维生素及矿物质和微量元素，是一举数得的新思路。真菌中甲壳素和壳聚糖分离纯化简单，所得产品性能优良，壳聚糖的脱乙酰度为85%～90%，对金属离子的吸附能力大，特别适合用于处理含重金属离子较多的废水；真菌中的几丁质复合一些糖类物质，具有特殊的生理功能。

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The Progress of Chitin Extracted from Crustaceans，Insect and Fungi

LIYan-yan，ZHANGShan-shan，RENGuo-dong
（Collegeof Life Sciences，Baoding 071002，Hebei，China）

Chitin is widely found in shrimp shells， the exoskeletons of insects， and fungal cell walls. Thetraditional production method of chitin is the use of shrimp shells as raw material， chitin in shrimp shellsaccounts for 20 % to 30 %， including traditional acid-base chemical method， EDTA technique， and the way ofenzyme solution in recent years. Resource insects and fungi was becoming the focus of research and developmentin recent years. Insects have the characteristics of higher protein content and lower inorganic salt content. Wefrequently make use of acid-base method to extract chitin from insect， but the plan is not as like as shrimpshells. Chitin and chitosan closely intertwined with each other exist in the cell wall in fungi. we make someimprovement according to the acid-base method to extract them.

chitin；chitosan；crustacea；insect；fungi

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.033

2013-12-14

河北省自然科学基金-石药集团医药联合研究基金（CSPC，E2013201205）；河北省高等学校科学技术研究青年基金项目（Q2012140）

李彦艳（1980—），女（汉），副教授，博士，主要从事生物材料、食品保鲜等研究。