上、下坡跑台运动对去卵巢小鼠破骨细胞分化NF-κB信号通路的影响

马涛 李世昌

1 齐鲁师范学院（济南250200）

2 华东师范大学

骨组织的正常生长及更新有赖于骨吸收与骨形成的动态平衡[1]。由破骨细胞作用的骨吸收是骨重建的起点，它可以清除损伤或没有承载功能的骨组织，继而启动由成骨细胞作用的骨形成过程， 使骨组织始终处在不断动态更新的过程中[2]。 我们前期的研究[3]已经研究了下坡跑运动对去卵巢小鼠成骨细胞分化和骨形成的影响， 发现下坡跑运动能够促进去卵巢小鼠成骨细胞的分化和骨形成作用。然而，运动对去卵巢小鼠破骨细胞分化的影响及分子机制还少见报道。

在某些状态下， 破骨细胞数量异常及功能紊乱会发生骨量过分减少的疾病， 如骨吸收功能亢进的骨质疏松症等[4]。妇女绝经后骨质疏松症就是由于绝经后雌激素迅速下降引起破骨细胞大量生成及活化造成的[5]。抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）属于溶酶体酶，具有5a和5b两个亚型，后者由破骨细胞特异性释放[6]，因此，骨组织中TRAP的分泌及表达量可以间接反映破骨细胞生成及活化情况。 在破骨细胞的分化和活化过程中，OPG-RANKL-RANK系统起着至关重要的作用，目前发现破骨细胞内与OPGRANKL-RANK相关的信号转导通路主要有NF-κB信号通路、MAPK信号通路、Ca2+/CN/ NFAT信号通路、PI3K/Akt信号通路和蛋白激酶C信号通路等。 其中，NF-κB信号通路是破骨细胞分化和活化最重要的一条通路[7，8]。

已有研究表明[2]，适度运动可有效降低妇女绝经后的骨质流失， 从而有效防止妇女绝经后骨质疏松症的发生。 运动时骨代谢调节激素的变化以及骨组织所受的机械应力均可能对骨代谢产生影响。 本研究探讨运动对去卵巢小鼠破骨细胞分化的影响， 以及NF-κB信号通路在介导运动对破骨细胞分化影响过程中的作用， 并进一步深入研究运动影响骨组织的细胞及分子机制； 本研究还探索上坡跑和下坡跑两种不同方式的运动对骨组织影响的差异， 进一步丰富防治骨质疏松的运动方式。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

主要试剂：Citrate Solution （Sigma）、Acid Phosphatase、Leukocyte （TRAP） Kit（Sigma）、BCA蛋白定量试剂盒（碧云天）、胰蛋白酶（碧云天）、红细胞裂解液（碧云天）、溴酚蓝（上海生工）、TEMED（明睿生物）、Glycine（明睿生物）、β-actin一抗（兔抗鼠，Santa Cruz）、各目的蛋白一抗（兔抗鼠，Santa Cruz）、Odyssey荧光二抗（山羊抗兔，Odessey）。

主要仪器：包埋机（Leica）、切片机（Leica）、捞片机（Leica）、烤片机（Leica）、Leica DM4000电子显微镜（Leica）、图象分析软件Image-Pro Plus 5.0、UV1102分光光度计（上海天美）、Odyssey红外荧光扫描成像系统（eBioscience）。

1.2 动物分组及训练方案

32只小鼠在本实验中心动物房适应性喂养1周，然后随机分为4组，即假手术安静组（S组，n = 8）、去卵巢安静组（O组，n=8）、去卵巢上坡跑组（U组，n = 8）、去卵巢下坡跑组（D组，n=8）。动物以1%戊巴比妥钠（0.1 g/kg）经腹腔麻醉后， 剪除长毛， 分别在脊柱两侧切开背肌1 cm切口，假手术安静组小鼠行去卵巢假手术，仅去除卵巢周围少量脂肪组织，其余3组小鼠均摘除卵巢，用可吸收的羊肠线缝合伤口，在伤口外涂少量红霉素软膏。

假手术安静组和去卵巢安静组在笼中正常饲养，不进行任何训练， 去卵巢上坡跑组和去卵巢下坡跑组于去卵巢手术后7天开始训练，训练方案与本实验室前期小鼠上、下坡跑台训练方案一致[9，10]（表1）：

1.3 取材

于运动组小鼠最后一次训练结束24 h后，摘眼球取血处死小鼠。 取其左侧股骨，投于4%多聚甲醛溶液中固定，待做石蜡切片，进行骨组织TRAP染色。 取其两侧肱骨、胫骨和右侧股骨，放入PBS中，以备对骨髓细胞进行破骨细胞分化诱导培养，待测破骨细胞分化过程中NFκB信号通路p65、p-p65、IκBα和p-IκBα的蛋白表达。

1.4 测试方法

1.4.1 股骨抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及计量

脱钙及包埋：将小鼠左侧股骨在4%PFA溶液中4℃冰箱过夜，第2天4%PFA换液1次。 24小时后，将组织投入10%EDTA溶液脱钙1周。1周后10%EDTA换液1次，继续脱钙1周。双蒸水清洗后将组织投入PBS，室温静置2～3小时。 梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。

TRAP染色：5 μm厚度切片，展片，捞片，烤片，二甲苯脱腊，梯度酒精水化，双蒸水清洗。 配制TRAP染色固定液和染液，加入固定液，室温固定30 s。双蒸水清洗后加入染液，37℃水浴中染色4小时。 用双蒸水清洗，封片保存。

表1 运动组小鼠训练方案

拍片及计量：Leica DM4000电子显微镜拍照，用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件统计股骨骨骺部位TRAP阳性染色区域的平均光密度值 （average optical density，AOD） 和平均阳性染色面积百分比（average positive staining area percentage，APSAP）。

1.4.2 破骨细胞原代培养及NF-κB信号通路蛋白检测

破骨细胞原代培养及NF-κB信号通路蛋白的制备： 骨髓造血干细胞的搜集方法同本实验室的前期研究文献相同[11]，之后将干细胞接种于6孔板，密度为每孔6×105个细胞，加入10 ng/ml的M-CSF培养2天，干细胞逐渐分化为破骨细胞前体， 然后加入10 ng/ml 的RANKL 刺激15分钟，搜集细胞蛋白。经0.05%胰蛋白酶消化后用预冷的PBS漂洗3次，加入450 μl裂解液，细胞刮棒刮出细胞裂解物， 在超声细胞破碎仪中以最大强度超声4次，每次15～30 s，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15 s，加入Laemmli 样品缓冲液混匀。100 ℃水浴3分钟，10000 g离心10分钟，取出上清液，将其移入另一洁净试管中，将所得的蛋白质样品于-20 ℃存放待测。

Western blot 测定破骨细胞前体NF-κB信号蛋白表达： BCA法测定蛋白总浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，丽春红染色，晾干后根据蛋白质maker标志和目的蛋白的分子量剪膜。 5%的脱脂牛奶封闭后进行抗体孵育，一抗和荧光二抗浓度均为1∶2000。 Odyssey荧光扫描及测试，将膜放在odyssey荧光凝胶成像系统扫描、拍照，并用odyssey凝胶图像处理系统进行数据分析，以待测蛋白与内参蛋白的平均密度之比作为待测蛋白的相对表达水平。

1.5 数据统计处理

各检测结果以均数±标准差表示，用SPSS12.0 软件进行方差分析，以P ＜0.05为差异显著性标准，以P ＜0.01 为差异非常显著性标准。

2 结果

2.1 股骨骨骺TRAP 染色计量

成熟的破骨细胞分泌破骨细胞特异性酶——抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），经TRAP染色后破骨细胞细胞质呈红色阳性染色。从图1和图2可以看出，呈红色阳性染色的破骨细胞多分布于骨骺、 骺板以及干骺端的骨吸收陷窝内，沿骨吸收陷窝边缘排列，以骺板部位的破骨细胞最为密集， 另外在皮质骨的外表面也分布有大量红色阳性染色的破骨细胞。

由表2可知， 去卵巢安静组股骨TRAP阳性染色区域的AOD和APSAP均较假手术安静组显著升高（P＜0.01）；与去卵巢安静组相比，两运动组股骨TRAP阳性染色区域的AOD和APSAP均显著降低（P ＜0.01，P ＜0.05）； 两运动组之间相比较， 去卵巢下坡跑组股骨TRAP阳性染色区域的AOD和APSAP均较去卵巢上坡跑组显著降低（P ＜0.01）。

图1 股骨TRAP染色整体图

表2 股骨骨骺TRAP染色计量

2.2 破骨细胞前体IκBα和p-IκBα蛋白表达

如图3所示：各组小鼠破骨细胞前体IκBα蛋白相对表达量无显著性差异， 而p-IκBα蛋白相对表达量组间差异显著。 去卵巢安静组p-IκBα蛋白相对表达量显著高于假手术安静组（P ＜0.01）；两运动组p-IκBα蛋白相对表达量显著低于去卵巢安静组（P ＜0.01）；而两运动组相比较， 去卵巢下坡跑组p-IκBα蛋白相对表达量显著低于去卵巢上坡跑组（P ＜0.01）。

图2 股骨骨骺TRAP 染色图250×

2.3 破骨细胞前体p65和p-p65蛋白表达

如图4所示： 各组小鼠破骨细胞前体p65蛋白相对表达量无显著性差异，而p-p65蛋白相对表达量组间差异显著。去卵巢安静组p-p65蛋白相对表达量显著高于假手术安静组（P ＜0.01）；两运动组p-p65蛋白相对表达量显著低于去卵巢安静组（P ＜0.01）；而两运动组相比较，去卵巢下坡跑组p-p65蛋白相对表达量显著低于去卵巢上坡跑组（P ＜0.05）。

3 讨论

3.1 上、下坡跑台运动对去卵巢小鼠骨组织TRAP的影响

骨重建是一个复杂的过程， 其主要与破骨细胞及成骨细胞的代谢过程有关， 涉及到破骨细胞作用的骨吸收和紧随其后的成骨细胞作用的骨形成[5]。妇女绝经后骨质疏松症就是由于绝经后雌激素迅速下降引起破骨细胞大量生成及活化导致的[12]。TRAP属于溶酶体酶，它包括多种同工酶，主要存在于骨、前列腺、血小板、红细胞和脾脏等。 TRAP各种同工酶具有不同的属性，如骨的同工酶具有抵抗L（+）-酒石酸盐抑制的作用，而前列腺的同工酶可被有机酸所抑制。 TRAP属于酸性磷酸酶的第5类同工酶[13]。 TRAP具有5a和5b两个亚型，后者由破骨细胞特异性释放[6]。破骨细胞在骨吸收过程中特异性释放TRAP，因此，骨组织中TRAP的分泌及表达量可以间接反映破骨细胞生成及活化情况，TRAP是一个有价值的骨吸收标志物[14]。 血清中的TRAP检测比较简便，既可以用动态方法测定其活性（根据对酒石酸盐抵抗的程度）， 也可以应用TRAP的抗体直接进行免疫测定。 但是，血液循环中的TRAP也来源于其它非骨组织细胞，如巨噬细胞等[15]。 虽然有部分资料已表明，血清中的TRAP可用于评估骨吸收状态， 但目前对TRAP是否可在骨质疏松中作为评价骨吸收的标志物仍未见大量研究。 其主要原因为血清TRAP并不具有很强的骨组织特异性，以及标本冰冻后不稳定；此外，血中的多种酶抑制剂影响了TRAP的敏感性[16]。 本研究采用骨组织TRAP染色方法直接检测局部骨组织TRAP的表达及分布，弥补了血清TRAP检测方法对骨组织特异性不高的缺点， 能够较准确地反映骨组织中破骨细胞特异性标志酶TRAP的表达量，从而间接反映局部骨组织破骨细胞的生成及活化情况。

图3 各组小鼠破骨细胞前体IκBα和p-IκBα蛋白表达

图4 各组小鼠破骨细胞前体p65和p-p65蛋白表达

本研究结果显示： 小鼠去卵巢后骨组织破骨细胞特异性酶TRAP大量生成，显示去卵巢手术可引起小鼠骨组织破骨细胞的大量分化和活化， 从而使骨吸收作用大大增强，增加骨质疏松风险。而跑台运动可以显著降低骨组织破骨细胞特异性酶TRAP生成，这说明跑台运动有效地抑制了去卵巢后小鼠骨组织中破骨细胞的大量生成及活化，从而有效阻止了骨吸收。该结果和本实验室的前期研究结果相吻合， 本实验室的前期研究结果[9]显示，跑台运动能够显著阻止小鼠去卵巢后骨密度和骨结构出现的退行性变化， 从而有效防止骨质疏松的发生，且体现出运动方式的差异性，即下坡跑效果优于上坡跑。

3.2 上、下坡跑台运动对去卵巢小鼠破骨细胞分化NFκB通路的影响

在破骨细胞的分化和活化过程中，OPG-RANKLRANK系统起着至关重要的作用[17]。RANKL和破骨细胞前体细胞膜上的RANK结合后， 通过连接蛋白TRAFs（TRAF2、TRAF5、TRAF6，其中主要是TRAF6），激活下游多种信号分子， 引起一系列信号转导反应和细胞生物学效应[18]。 目前发现破骨细胞内与RANK相关的信号转导通路主要有：NF-κB信号通路、MAPK信号通路、Ca2+/CN/NFAT信号通路、PI3K/Akt信号通路和蛋白激酶C信号通路等[19]。 其中，NF-κB信号通路是破骨细胞分化和活化最重要的一条通路， 研究表明NF-κB1和NFκB2双突变鼠缺少TRAP阳性破骨细胞[7，8]。 NF-κB属于NFκB/Rel家族，是一种重要的转录因子，RANKL的信号经RANK 传 递 给TRAF6，TRAF6 通 过NIK （NF-κB inducible kinase）和IKK（the IκB kinase）活化NF-κB。哺乳动物表达两类共5个Rel（NF-κB）蛋白[20]。 第1类蛋白包括RelA（P65）、C- Rel和RelB，这类蛋白作为成熟的产物合成， 不需要进一步蛋白酶解。 第2类蛋白包括NF-κB1 和NF-κB2，这类蛋白首先合成大的前体p105和p100，然后经过蛋白水解，最终分别成为成熟的p50和p52 NF-κB蛋白。 在细胞静息状态时，RelA或c-Rel和NF-κB组成的二聚体通过与IκB抑制蛋白结合而被保留在细胞质中， 最常见的形式为p50-p65-IκBα或p50-p65-IκBβ[21]。 在信号通路激活时，IκBα被IκB激酶（IKK）磷酸化，进而被泛素降解，从而使NF-κB二聚体与κBα脱离，脱离了κBα的NF-κB二聚体被激活，迅速进入细胞核并与相应靶基因的启动子结合， 通过启动和调控基因的转录来调节破骨细胞的分化、 功能和凋亡[22，23]。

在本研究中，与假手术安静组相比，去卵巢安静组小鼠破骨细胞前体p-p65和p-IκBα蛋白表达显著增加，而p65和IκBα蛋白表达则未见显著性变化。这说明小鼠去卵巢后，由于雌激素迅速减少，通过RANKL途径和其他途径激活了NIK和IKK， 使IκBα磷酸化程度提高，从而激活了破骨细胞分化的NF-κB信号通路， 促进破骨细胞分化，造成高转换型骨质疏松。但去卵巢安静组小鼠破骨细胞前体p65和IκBα蛋白表达并未比假手术安静组增加， 说明雌激素的迅速下降虽不能使NF-κB信号通路的p65和IκBα蛋白表达增加，但可以通过NIK和IKK使上述蛋白发生磷酸化而激活NF-κB信号通路。与去卵巢安静组相比， 两跑台运动组小鼠破骨细胞前体p-p65和p-IκBα蛋白表达显著下降，而p65和IκBα蛋白表达变化无显著性差异。 这说明，跑台运动可以通过抑制破骨细胞分化的NF-κB信号通路而影响骨代谢，使破骨细胞的生成得到有效抑制，从而减缓骨吸收速度。两跑台运动组之间相比较， 去卵巢下坡跑组对破骨细胞前体p-p65和p-IκBα蛋白表达的抑制效果更明显，且两组具有显著性差异。 这说明这两种应力方式不同的跑台运动，对骨代谢造成的影响也不同，下坡跑运动比上坡跑运动对抑制破骨细胞分化的NF-κB信号通路更有效。

3.3 上、 下坡跑台运动对去卵巢小鼠破骨细胞分化影响结果的差异性分析

在本研究中，对上、下坡跑台运动两种运动方式对去卵巢小鼠破骨细胞分化的影响进行了对比研究，尽管结果显示两种运动方式均能对去卵巢小鼠破骨细胞的过度分化起到有效的抑制作用，然而对比之下，下坡跑运动效果显著优于上坡跑运动。 产生这种运动方式效果差异的原因， 我们认为主要是在两种运动方式过程中，小鼠骨组织，特别是下肢骨组织所受的力学刺激不同。在运动过程中，骨组织除受到骨骼肌收缩对其产生的牵拉、挤压和剪切等力学刺激外，来自于地面的反作用力对其的机械应力则是最主要应力因素， 而下坡跑运动过程中小鼠下肢骨所受到的来自跑台的反作用力明显大于上坡跑过程中小鼠下肢骨受到的应力，在本实验室前期发表的论文中已有对此结果的相关讨论[9]。

4 总结

小鼠去卵巢后骨组织破骨细胞特异性酶TRAP大量生成， 显示去卵巢手术可引起小鼠骨组织破骨细胞大量分化和活化，从而使骨吸收作用大大增强，增加骨质疏松风险。

跑台运动可通过抑制破骨细胞分化过程中p65和IκBα蛋白的磷酸化而有效抑制破骨细胞分化的NF-κB信号通路，从而有效抑制骨吸收作用，且下坡跑效果优于上坡跑。

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