3周大运动量训练对大鼠骨骼肌mTOR信号通路的影响

马铁 曾凡星

1 沈阳体育学院（辽宁沈阳110102）

2 北京体育大学

大运动量训练是运动训练的重要原则之一， 可以有效提高运动员的运动成绩[1]。 同时，运动训练也会影响骨骼肌的合成能力，表现出即时的应激性[2，3]和长期的适应性[4，5]。间歇性冲刺训练后，骨骼肌蛋白合成能力的提高伴随着运动能力的改善[6]，说明运动成绩与骨骼肌蛋白合成能力密切相关。研究已证实，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of Rapamycin，mTOR）对所有细胞的蛋白合成有调控作用[7]。 mTOR磷酸化水平提高可以促进骨骼肌细胞增殖与肥大， 维持骨骼肌质量[8]。史仍飞等[9]发现，大鼠进行8周负重游泳训练，雷帕霉素（mTOR特异性阻断剂）阻断运动组的骨骼肌质量低于单纯运动组，表明运动训练通过mTOR信号通路影响骨骼肌蛋白合成。

但现有的研究中， 对于骨骼肌蛋白合成代谢和mTOR信号通路在大运动量训练过程中变化情况尚未见明确报道。因此，本研究采用中等强度和大强度相结合3周大运动量大鼠跑台训练，在每周训练后测试骨骼肌mTOR及其下游信号70KD核糖体蛋白S6激酶（70-kD S6 protein kinase，p70S6K）、真核起始因子4E结合蛋白1（eIF4E-binding protein 1，4EBP1）的蛋白表达和磷酸化水平，探讨在这一过程中，骨骼肌蛋白合成变化规律和相应信号蛋白变化特点。

1 研究方法

1.1 实验动物和分组

7周龄雄性SPF级SD大鼠36只[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2012-001]，分笼饲养，4只/笼，国家标准啮齿类动物饲料，自由饮食。 在北京体育大学科研实验中心实验动物房饲养。

大鼠适应性训练1周后， 按体重随机分成对照组（C1、C2、C3）和运动组（E1、E2、E3），共6组，每组6只。对照组不运动，运动组进行3周连续的大运动量训练。

1.2 训练方案

参考Bedford[10]、田野[11]等的研究和大运动量训练的基本原则[12]，制定大鼠大运动量训练方案。 训练周期：3周，训练频率：6天/周，训练强度：中等强度（20m/min，坡度10%，相当于70%～75%VO2max）、大强度（26 m/min，坡度10%，相当于80%～85%VO2max）。单次训练时间：中等强度运动起始运动时间90 min，逐次增加；大强度训练时间均为60 min。 周训练计划：中等强度训练4天、大强度训练2天，具体方案见表1。

表1 3周大运动量训练方案

1.3 取材

大鼠在每周训练后， 末次运动后禁食12 h，25%乌拉坦腹腔麻醉，腹主动脉取血，取腓肠肌，除去可见筋膜和脂肪，称重。 剥离白腓肠肌，9%生理盐水洗净，锡纸包裹迅速放入液氮，随后转入-80℃冰箱。 取材部位与时间参考朱一力结果[13]。

图1 大运动量训练期间取材安排

1.4 Western blot 测定肌球蛋白重链 （myosin heavy chain，MHC）、mTOR、mTOR （ser2448）、p70S6K、p70S6K（Thr389）、4EBP1、4EBP1（Thr37/46）表达水平

白腓肠肌0.1 g， 剪碎、 液氮研磨，1 ml匀浆液，混匀，无可见颗粒。 低温高速离心（4℃，12000 g，10 min），提取上清液，分装放入-80℃冰箱。 用BCA法测试骨骼肌匀浆液蛋白浓度。 灌制浓缩胶 （10%） 和分离胶（mTOR，mTOR （ser2448），MHC 6% ，p70S6K，p70S6K（Thr389） 10%，4EBP1，4EBP1（Thr37/46） 15%），恒 压电泳（浓缩胶80 V，30 min；分离胶100 V，120 min），转膜至NC膜 （半干转，20 V，90 min），5%牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）封闭90 min。一抗4℃封闭过夜[MHC，1∶1000；mTOR，1∶1000；mTOR（ser2448），1 ∶1500；p70S6K，1 ∶1000、p70S6K （Thr389），1 ∶1000；4EBP1，1∶800；4EBP1（Thr37/46），1∶1000；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），1∶1000；MHC抗体购自Abcom公司，GAPDH抗体购自Santa公司， 其余抗体购自CST公司）， 次日晨，TBST洗膜，二抗孵育90 min（二抗购自NEB公司]，TBST洗膜，滴发光液，曝光，拍照。使用Quanity One软件进行图像光密度值分析， 以GAPDH为内参。 目的蛋白相对含量＝目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.5 统计学分析

数据采用均数±标准差表示。 统计分析使用SPSS13.0软件，采用独立样本t检验。 P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大运动量训练对大鼠腓肠肌湿重和MHC表达的影响

由图2和图3可以看出，与C1组相比，E1组腓肠肌湿重降低、MHC升高， 但均无统计学意义。 与C2组相比，E2组腓肠肌湿重和MHC降低，但无统计学意义。 与C3组相比，E3组腓肠肌湿重显著降低 （P < 0.05），MHC显著降低（P < 0.01）。

2.2 大运动量训练对腓肠肌mTOR信号通路蛋白表达的影响

由图4可以看出， 与C1组相比，E1组mTOR蛋白表达降低、p70S6K蛋白表达升高， 但均无统计学意义；4EBP1蛋白表达显著升高（P < 0.01）。 与C2组相比，E2组mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表达降低， 但均无统计学意义。与C3组相比，E3组mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表达显著降低（P < 0.05）。

图2 大运动量训练过程中大鼠腓肠肌湿重变化

图3 大运动量训练期间大鼠腓肠肌MHC变化

2.3 大运动量训练对mTOR信号通路蛋白磷酸化水平的影响

图4 大运动量训练期间大鼠腓肠肌mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表达的变化

图5 大运动量期间大鼠腓肠肌mTOR（Ser2448） 、p70S6K（Thr389）和4EBP1（Thr37/46）磷酸化水平的变化

由图5可以看出， 与C1组相比，E1组mTOR磷酸化水平升高，但无统计学意义；p70S6K磷酸化水平显著升高（P < 0.01）；4EBP1磷酸化水平显著升高（P < 0.05）。与C2组相比，E2组mTOR磷酸化水平显著降低 （P <0.01）；p70S6K磷酸化水平显著降低 （P < 0.05）；4EBP1磷酸化水平升高，但无统计学意义。 与C3组相比，E3组mTOR磷酸化水平、p70S6K磷酸化水平显著降低（P <0.01）；4EBP1磷酸化水平降低，但无统计学意义。

由图6可以看出，在大运动量训练第1周结束和第3周结束时，mTOR信号通路蛋白磷酸化水平与蛋白表达比值均>1。

图6 大运动量训练过程中mTOR及其下游信号通路蛋白磷酸化

3 讨论

3.1 大运动量训练对骨骼肌蛋白合成的影响

骨骼肌的湿重或围度是反映训练对骨骼肌合成代谢影响的直观指标。 研究显示，适宜运动强度和运动量的抗阻训练可提高或保持骨骼肌质量或横截面积[14，15]。本研究显示，在大运动量训练前期，运动组骨骼肌湿重均低于同期对照组，但无统计学意义。 同时进行纵向对比发现，前2周训练后，运动组大鼠骨骼肌湿重与对照组相似，呈升高趋势。 这种变化可能与生长因素有关，研究发现，大鼠在青春期到成年阶段，骨骼肌质量随周龄的增加而增加[16]，同时也可能由于骨骼肌应对大运动量训练刺激出现适应性反应， 骨骼肌蛋白质合成快于蛋白质分解，以致蛋白质积累[17]。 朱晗[18]的研究也表明，采用与本研究相似运动方式训练1周，大鼠腓肠肌质量和总蛋白表达呈现增加趋势。

也有研究发现，大鼠进行6周力竭游泳训练，在训练的第4～6周取材，训练组大鼠不同类型的骨骼肌湿重均显著低于对照组[19]，过度训练降低骨骼肌的总蛋白含量[20]，说明不适宜运动训练会降低骨骼肌的蛋白合成能力。 本研究结果同样显示大运动量训练第3周运动组骨骼肌湿重显著低于对照组， 并且也低于前期的运动组，表明3周大运动量训练的疲劳积累降低了骨骼肌蛋白的合成能力。

通过对骨骼肌MHC表达量的测试， 更进一步准确地反映出骨骼肌蛋白合成能力的变化。有研究显示，适宜的训练可提高骨骼肌MHC表达并且与训练模式无关，12周力量与耐力相结合的训练使骨骼肌Ⅱa型肌纤维含量和横截面积增加[21]。 但通过建立大鼠力量训练疲劳模型发现， 大鼠在进行12周未充分休息的大强度力量训练后， 跖肌中的快肌纤维横截面积显著降低，IIA和IID型MHC肌纤维显著减少[22]。本研究结果也表明，在大运动量训练的前2周，与同期对照组相比，骨骼肌MHC略有升高或并无显著变化，但在3周训练后MHC显著降低，进一步证明了大运动量训练过程中，骨骼肌蛋白合成能力经历了先升高后降低的过程。

本研究结果表明， 短时间大运动量训练对骨骼肌蛋白合成有一定的促进作用，但随着训练时间的延长，疲劳积累增加， 恢复时间相对减少将导致骨骼肌蛋白合成代谢能力下降，抑制骨骼肌蛋白合成。

3.2 大运动量训练对大鼠骨骼肌mTOR信号通路的影响

mTOR主要通过调节mRNA翻译启始和延长的效率影响细胞合成。 这种作用的发挥主要通过p70S6K和4EBP1两条相对独立的下游信号通路完成， 并且以磷酸化方式提高二者活性[23]。 当4EBP1的Thr37/46位点被磷酸化，则可解除其与真核翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）结合，活性位点暴露，促进蛋白质翻译启始[24]。 p70S6K是核糖体40S小亚基S6蛋白激酶，其被磷酸化活化后，可以通过激活S6蛋白， 促进5'TOP mRNA翻译蛋白的起始。 5'TOP mRNA主要翻译产物包括许多翻译元件成分如核糖体蛋白、翻译延伸因子1α、翻译延伸因子2和poly（A）结合蛋白[25]。 因此，mTOR通过其下游信号蛋白，全面调节蛋白质翻译过程中的关键环节，具有快速（几分钟）激活翻译启始的短期作用和通过增加核糖体及其他翻译组件数量提高细胞翻译能力的长期（数小时）作用[26]。

研究显示，运动训练改变mTOR及其下游信号蛋白表达，7周无负重游泳训练（1.5h/d，5d/周）后，与对照组相比，大鼠mTOR蛋白表达显著提高[27]。 对老年大鼠进行为期3个月的有氧运动，与对照组相比，训练组大鼠骨骼肌的合成代谢加强，腓肠肌mTOR蛋白总量显著增加，同时腓肠肌蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）总量增加， 因此作者认为有氧训练对于骨骼肌蛋白合成的促进作用通过Akt-mTOR途径完成，但其结果并未改变p70S6K的蛋白表达[28]，这可能与采用的训练方式是转轮跑，其强度相对较小有关。 因此可以看出，长期训练可以提高骨骼肌mTOR信号蛋白的表达， 但也应看到，信号蛋白表达可能与训练的负荷量和强度有关。

有研究表明，采用电刺激大鼠腓肠肌、隔天训练、共1周的方式模拟力量训练，并根据每天训练的次数分为1次组、12次组和18 次组， 结果显示大鼠腓肠肌p70S6K磷酸化水平在运动后均显著显著升高，1次组升高幅度最大； 而其蛋白表达均在12次组和18次组显著升高；只有18次组4EBP1蛋白表达显著升高[29]。 这一研究表明， 长期的训练会钝化一次性运动对骨骼肌信号蛋白的影响，相对于蛋白磷酸化水平，其蛋白表达的改变可能发生在运动对机体影响较为深刻的后期。 相对训练频次较低的间歇性力量和耐力（每2次训练至少间隔1天） 训练均未显著改变Akt、mTOR和p70S6K的蛋白表达[30]。 本研究也显示，与同期对照组相比，骨骼肌mTOR、p70S6K蛋白表达在训练的前2周均无显著变化，而显著降低均出现在大运动量训练的第3周，可能由于此阶段单次训练时间长，前期疲劳积累程度较大所致。同时也发现，大运动量训练过程中，同作为mTOR下游信号的p70S6K和4EBP1两者蛋白表达变化存在一定差异。 虽然三者变化趋势较为一致，相比较而言，p70S6K与mTOR保持更好的同步性变化。这与Ogasawara等[29]的结果相似， 其认为，4EBP1可能存在其他的调节作用通路。

运动训练同样会改变骨骼肌mTOR及其下游信号磷酸化水平。 李志刚[31]采用8周不同体重比例负重游泳训练， 比较后发现15%体重负重游泳对骨骼肌促合成作用最强，mTOR磷酸化水平最高。2周中等强度耐力训练可提高骨骼肌mTOR磷酸化水平和总蛋白表达，使其下游信号分子p70S6K和4EBP1磷酸化水平显著增加，并在运动后6～12小时达到最大水平，24小时后恢复[13]。以上研究表明，适宜的运动负荷可提高骨骼肌mTOR磷酸化水平。

本研究显示，在大运动量训练前期（1周后），mTOR及其下游信号的磷酸化水平均显著升高， 并且下游信号蛋白磷酸化升高幅度高于mTOR。 这与曾凡星等[32]的研究结果一致， 其发现大鼠在进行1周跑台训练后，腓肠肌mTOR及其下游信号p70S6K和4EBP1磷酸化水平均显著高于对照组，并认为mTOR通路信号分子磷酸化水平对运动训练较为敏感。mTOR信号通路磷酸化水平在大运动量训练前期的变化也表明， 此阶段训练量较为适宜，骨骼肌蛋白合成能力加强。 但在大运动量训练的后2周，mTOR及其下游信号磷酸化水平降低， 这与mTOR上游信号蛋白Akt磷酸化水平变化较为一致[33]，因此大运动量训练疲劳后可能通过Akt-mTOR通路抑制骨骼肌蛋白合成。

综合以上分析可以看出， 在系统的大运动量训练过程中，骨骼肌mTOR信号通路蛋白表达、磷酸化水平与MHC呈现出相似的变化过程，具有很好的同步性。进一步证明运动训练对骨骼肌蛋白合成的影响与mTOR密切相关[34]。 在大运动量训练前期，mTOR信号通路活性的增加是骨骼肌合成代谢加强的原因。反之，在大运动量训练结束后，mTOR信号通路蛋白表达的降低导致骨骼肌蛋白合成能力下降。

4 总结

mTOR及其下游信号通路参与了大运动量训练对骨骼肌蛋白合成的调节作用。 短期大运动量训练促进骨骼肌蛋白合成，与mTOR信号通路磷酸化水平提高有关。 3周大运动量训练降低骨骼肌蛋白合成能力，是由mTOR信号通路蛋白表达减少导致的。

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