功能性消化不良脾虚证动物模型的制作及评价

刘晶 李峰 唐旭东 马捷 葛东宇 李根茂 刘燕 刘艳阳 韩晨霞 吴卓耘

功能性消化不良表现为胃和十二指肠功能紊乱引起的症状，经检查排除引起这些症状的器质性疾病的一组临床综合征［1］。根据目前国际公认的功能性胃肠病诊断标准—罗马Ⅲ标准，功能性消化不良必须包括以下症状的一条或多条:(1)餐后饱胀不适;(2)早饱感;(3)上腹痛;(4)上腹烧灼感。并且没有可以解释上述症状的功能性疾病。同时还应满足诊断前，症状出现至少6 个月，近3 个月符合以上标准［2］。中医学认为，功能性消化不良可与“痞满”对应，其中脾气虚证是“痞满”一病的重要证型。根据其辨证标准［3-5］，“痞满”脾气虚证主症是:脘腹痞满或胀痛，食少纳呆。次症表现为纳少泛恶，嗳气呃逆，大便稀溏，疲乏无力，舌淡，苔薄白，脉细弦。根据上述诊断及辨证标准，对功能性消化不良脾虚证动物模型进行复制及评估。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Spargue-Dawley 雄性乳鼠45 只，7日龄，带母鼠，每只母鼠带5 只乳鼠，为其提供母乳。母鼠与所带乳鼠为一笼，饲养于清洁级动物房，12 小时节律，室温22℃，湿度:60% ～70%。母鼠以全价颗粒饲料喂养，自由饮水。实验动物均由斯贝福(北京)实验科技有限公司提供。［许可证号:SYXK(京)2012-0001］。

1.2 实验试剂及设备

1.2.1 自制改良多平台箱 改良多平台箱(110 cm×60 cm×40 cm)中固定15 个平台(直径6.5 cm，高8.0 cm)，在平台周边注满水，水温22℃，水面低于平台表面1.0 cm。大鼠放置在箱内平台上，可以在平台间活动，可自由饮食饮水，但无法正常休息，进而诱发大鼠疲劳。

1.2.2 实验试剂 碘乙酰胺，由西奥格玛公司提供;蔗糖，由拜尔迪公司提供。

1.3 功能性消化不良脾虚证动物模型的复制

模型复制参考功能性消化不良碘乙酰胺造模法［6］及改良多平台造模法［7］。

实验步骤:(1)适应性饲养3 天，12 小时昼夜节律，室温22℃，常规饲料喂养母鼠，并由母鼠提供母乳给乳鼠。(2)乳鼠10日龄，将乳鼠按笼随机分成2组，蔗糖组(15 只)，碘乙酰胺干预组(30 只)。蔗糖组每天以2%蔗糖溶液对乳鼠进行灌胃，0.2 mL/只，连续6 天。碘乙酰胺干预组每天以0.1%碘乙酰胺蔗糖溶液对乳鼠灌胃，蔗糖溶液浓度为2%，0.2 mL/只，连续6 天。之后正常饲养，饲养条件较之前不变。(3)饲养大鼠至3 周龄，断奶，剔除母鼠。并将大鼠分笼，每笼5 只，改用常规饲料饲养。(4)大鼠饲养至6 周龄，再次将实验大鼠分组。正常组(15 只):为之前以蔗糖溶液灌胃的大鼠;将碘乙酰胺干预组大鼠按体重随机分成2 组，模型1 组(15 只)，模型2组(15 只)。正常组与模型1 组正常饲养，模型2 组每天放入注水的平台箱内(18∶00 ～8∶00)进行疲劳诱发，连续14 天。箱内水每天更换，水温维持22℃。

1.4 功能性消化不良脾虚证动物模型评价

1.4.1 大鼠一般状态观察 每天对实验大鼠整体状态进行肉眼观察，观察大鼠皮毛色泽，耳廓颜色，精神状态及活动度，同时记录大鼠体重变化。

1.4.2 实验大鼠病理学检查 碘乙酰胺干预结束及小平台站立结束后，每组随机抽取2 只大鼠，观察大鼠胃病理学改变。

1.4.3 大鼠饮食情况统计 数据收集期间，每组随机抽取10 只大鼠单笼饲养，记录大鼠一天食物及饮水的消耗量。

1.4.4 糖水偏好试验 大鼠模型复制结束后，对实验大鼠进行糖水偏好试验［8-10］。每组随机抽取10只大鼠，进行试验。试验前，对大鼠进行糖水适应性训练。训练期间，大鼠单笼饲养，笼上同时放置两个水瓶，一瓶为1%的蔗糖溶液，另一瓶为正常饮用水。每隔12 小时，两个水瓶左右互换。训练连续进行48 小时。训练结束后，仅供应饮用水6 小时，随后禁食水18 小时，此后进入试验阶段。试验期间，保持大鼠单笼饲养，每笼上再次放置1%的蔗糖溶液及正常饮用水，持续3 小时。记录糖水及饮用水试验前后重量差值。计算糖水偏好百分比。糖水偏好百分比(SP)=糖水消耗量(g)÷［糖水消耗量(g)+饮用水消耗量(g)］。统计SP＞75%大鼠在本组中所占百分比，各组比较运用卡方检验。

1.4.5 胃肠敏感性试验 模型复制结束后，大鼠进行胃肠敏感性试验［6，11］。大鼠模型复制结束后，每组随机选取3 只大鼠，进行胃肠敏感性试验。试验前，大鼠禁食18 小时。1%戊巴比妥钠麻醉实验大鼠，按大鼠体重0.4 mL/100g 腹腔注射。切开大鼠腹部，曝露胃。在大鼠胃部作一切口，将气囊植入胃底部。气囊一端闭合，另一端接一PE 管。缝合胃切口，PE 管留在胃外，埋入皮下。缝合腹部切口。术后，大鼠单笼饲养，恢复一周。一周后，将PE 管从大鼠皮下取出，接压力计。将电极植入大鼠斜方肌肌群。用压力计向大鼠胃内气囊充气，气囊扩张分别至10 mmHg、20 mmHg、30 mmHg、40 mmHg、50 mmHg这5 个数值，每次扩张持续20 秒，间隔2分钟，同时检测在此胃内压下的斜方肌肌电变化。统计大鼠肌电变化率。

1.5 数据统计

数据采用SPSS 17.0 进行统计学分析。计量数据采用均值±标准差(±s)表示。多组数据，每组均成正态分布，采用方差分析。组间两两比较采用LSD检验。计数数据采用卡方检验。P ＜0.05 具有显著性差异;P ＜0.01 为极显著性差异，具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠一般状态

观察发现，模型组大鼠较正常组大鼠皮毛不泽，耳廓颜色较淡，懒惰嗜卧，活动度低。其中模型2 组较模型1 组更为明显。

2.2 大鼠体重变化

大鼠6 周龄时，即碘乙酰胺干预32 天后，将碘乙酰胺组大鼠按体重随机分组，对模型2 组进行小平台干预，并记录大鼠体重变化。小平台干预期间，正常组与模型1 组大鼠体重比较无显著差异(P＞0.1)，小平台干预后第7 天，模型2 组大鼠体重明显低于正常组及模型1 组(P ＜0.01)，此差异一直持续至小平台干预结束。见表1。

表1 小平台干预后大鼠体重变化(±s，g，n=15)

表1 小平台干预后大鼠体重变化(±s，g，n=15)

注:与正常组比较，aP ＜0.01;与模型1 组比较，bP ＜0.01

时间 正常组 模型1 组 模型2组209.8 ±6.67 201.2 ±4.21 206.6 ±5.45第7 天 242.3 ±8.13 239.4 ±4.50 206.4 ±6.34ab第14 天 288.1 ±9.79 303.5 ±4.77 219.4 ±8.96第0 天ab

2.3 大鼠胃病理切片

如图所示，碘乙酰胺干预后，幼年大鼠胃组织与蔗糖组比较除黏膜表面略有疏松外，无明显变化，未见深层损伤及炎性浸润，如图1。大鼠成年后，模型1 组与正常组比较，组织也无明显差异。小平台干预组(模型2 组)胃未见损伤及炎性浸润，胃组织与正常组，模型1 组比较也无明显差异。各组均未见胃损伤(如图2)。

图1 碘乙酰胺干预后大鼠胃病理

2.4 大鼠进食量及饮水量统计

小平台结束后，记录各组大鼠进食量及饮水量。模型1 组及模型2 组大鼠进食量均明显低于正常组(P ＜0.05)，与正常组及模型1 组比较，模型2组进食量减少更为显著(P ＜0.01)。各组大鼠饮水量情况与进食情况相似，两模型组饮水量均低于正常组(P ＜0.05)，且模型2 组较正常组，模型1 组减少更为显著(P ＜0.01)。如表2。

表2 各组大鼠饮食情况统计(±s，n=10)

表2 各组大鼠饮食情况统计(±s，n=10)

注:与正常组比较，aP ＜0.05;与正常组比较，bP ＜0.01;与模型1 组比较，cP ＜0.01

组别 进食量(g) 饮水量(g)21.5 ±0.58 39.2 ±2.3模型1 组 19.5 ±0.43a 30.0 ±1.52a模型2 组 15.4 ±0.79bc 27.3 ±3.34正常组bc

2.5 糖水偏好试验

每组随机抽取10 只，进行糖水偏好试验。各组大鼠糖水消耗量比较，无显著差异(P＞0.1)。但各组大鼠，糖水偏好百分比＞75%大鼠只数占各组总数百分比有明显差异，模型1 组与模型2 组均显著低于正常组(P ＜0.01)。如表3。

表3 各组大鼠糖水偏好试验(±s，n=10)

表3 各组大鼠糖水偏好试验(±s，n=10)

注:与正常组比较，aP ＜0.01

组别 糖水消耗量(g) SP＞75%(只) 百分比(%)22.5 ±3.52 8 80模型1 组 15.9 ±1.57 1 10a模型2 组 17.0 ±5.42 2 20正常组a

2.6 胃肠敏感性试验

向大鼠胃部植入的气囊充气，检测不同胃内压下，大鼠颈部肌电变化率。在胃内压10 mmHg，三组肌电变化率比较无显著性差异(P＞0.1)，至20 mmHg时，两模型组肌电变化率较正常组明显升高(P ＜0.01)，但两模型组之间比较无显著差异(P＞0.1)。30 mmHg 时，三组比较与20 mmHg 一致;40 mmHg时，模型1 组与正常组比较有极显著性差异(P ＜0.01)，模型2 组与正常组比较有显著性差异(P ＜0.05)，两模型组之间没有显著差异(P＞0.1)。50 mmHg 时，两模型组与正常组比较有显著差异(P ＜0.05)，两模型组之间无显著性差异(P＞0.1)。模型组大鼠肌电变化率在30 mmHg 达到峰值，之后变化率开始减小。正常组大鼠肌电变化率在40 mmHg时达到峰值，之后变化率开始减小。如表4及图3。

表4 不同胃内压下大鼠颈部肌电变化率(±s)

表4 不同胃内压下大鼠颈部肌电变化率(±s)

注:与正常组比较，aP ＜0.01;与正常组比较，bP ＜0.05

扩张压力 正常组 模型1 组 模型2组70 20mmHg 179.30 ±22.46 282.49 ±17.22a 288.83 ±34.53a 30mmHg 254.93 ±30.05 420.12 ±29.15a 412.55 ±61.85a 40mmHg 315.41 ±20.17 412.35 ±33.53a 378.80 ±23.87b 50mmHg 265.80 ±34.06 333.88 ±39.09b 345.23 ±14.36 10mmHg 103.15 ±4.69 114.94 ±13.53 114.56 ±14.b

图3 肌电变化率及示意图

3 讨论

功能性消化不良是西医病名，诊断要点包括:(1)餐后饱胀不适，早饱感，上腹痛，上腹烧灼感至少出现1 项或多项;(2)慢性起病，病症持续至少6个月;(3)排除其它器质性疾病。功能性消化不良包括两个亚型。其中以中等程度上腹痛为主要症状的，称为上腹痛综合征，以餐后上腹部饱胀不适为主要症状的，称为餐后不适综合征。有研究发现，功能性消化不良上腹痛综合征患者的胃顺应性降低较健康人明显，而餐后不适综合征患者在胃敏感性增高方面更为显著［12］。

中医内科学将功能性消化不良归入“痞满”的范畴。研究功能性消化不良中医学证候分布发现，各中医证型共有症状为腹胀［13］。而根据西医学的疾病诊断，单纯的上腹痛综合征并不包括腹胀这一症状。因此，中医学认为的功能性消化不良(痞满)，应属于西医餐后不适综合征的范畴，伴或不伴有上腹痛综合征。根据中医功能性消化不良(痞满)脾胃虚弱证的辨证标准［3-5］，其主症为脘腹痞满或胀痛，食少纳呆，次症为恶心，嗳气，呃逆，疲乏无力，舌淡，苔薄白，脉细弦。

因此功能性消化不良脾虚证动物模型评价标准，首先应符合罗马Ⅲ功能性消化不良诊断标准，其次应符合中医脾胃虚弱证中的上腹胀，食少，食欲减退三大主症。根据这些标准，实验选择了国际上使用的碘乙酰胺造模法作为功能性消化不良模型［6］，对幼年大鼠胃进行刺激，从而降低成年大鼠胃功能。同时，根据中医“脾主肌肉”，“劳倦伤脾”理论，复合小平台站立因素，诱发大鼠疲劳，进而加重脾虚。

围绕中西医诊断标准，实验对模型进行评价。本次研究造模周期为46 天，符合功能性消化不良慢性起病的标准。而对胃组织染色发现，模型组未出现炎性浸润及深层损伤，排除胃炎及胃溃疡等引起该症状的器质性疾病。从饮食情况来看，模型组较正常组饮食显著减少，其中以模型2 组减少更为明显，这一结果符合中医脾虚证中的“食少”一症。糖水偏好试验反映大鼠对喜爱食物的兴趣程度。实验发现，模型组大鼠糖水偏好百分比＞75%，在本组中所占百分比较正常组明显降低，结合进食量减退，可以反应大鼠食欲下降情况。这一症状也符合功能性消化不良脾虚证纳呆这一主症。上腹胀是功能性消化不良脾虚证最重要的主症，研究发现，上腹胀可能与胃对机械扩张敏感性增高有关［12］。临床中也用球囊试验检测胃功能。本次研究中，借用球囊试验检测大鼠胃敏感性，研究发现在同等胃内压的条件下，两模型组大鼠均对胃内扩张的感受更为敏感，反映了大鼠胃敏感性增高。另外，两模型组大鼠出现感觉至不能耐受的胃内压变化较正常组明显降低，在一定程度上反应了模型组胃顺应性降低，其中以施加小平台因素的模型2 组较为明显。球囊试验反映了大鼠腹胀及早饱方面的程度，结果显示，模型组大鼠可出现腹胀，早饱样症状，符合功能性消化不良脾虚证主症。

从功能性消化不良脾虚证中西医诊断标准来看，两模型组均符合疾病脾虚证的诊断标准，但两组在一些指标上还有差异。首先，施加小平台因素的模型2 组大鼠体重显著低于正常组及模型1 组;其次，模型2 组大鼠饮食减少较模型1 组更为显著。另外，从功能性消化不良脾虚证次症来看，模型组大鼠较正常组大鼠皮毛不泽，耳廓颜色较淡，懒惰嗜卧，活动度低。其中模型2 组较模型1 组更为明显。这些符合脾虚证疲乏无力，面色少华的特点，而模型2 组这些特点更为明显。

综上，从功能性消化不良脾虚证主症来看，碘乙酰胺干预的模型1 组与复合小平台劳倦因素的模型2 组，均符合功能性消化不良脾虚证动物模型。从次症来看，模型1 组与模型2 组分属于脾虚证的不同亚型。李东垣在《脾胃论》中提到:“脾胃均虚，则不能食而瘦，或少食而肥。”本研究中，模型1 组符合“少食而肥”的脾虚证，而模型2 组符合“不能食而瘦”的脾虚证，而施加劳倦因素的模型2 组脾虚证表征更为明显。这一研究所建立的模型，将为功能性消化不良脾虚证的深入研究提供动物模型支持。

［1］陆再英，钟南山.内科学［M］.北京:人民卫生出版社，2008.

［2］罗马委员会.功能性胃肠病罗马Ⅲ诊断标准［J］.胃肠病学，2006，11 (12):761-765.

［3］郑筱萸.中药新药临床研究指导原则［M］.北京:中国医药科技出版社，2002:134.

［4］张万岱，危北海，陈治水，等.功能性消化不良的中西医结合诊治方案(草案)［J］.中国中西医结合消化杂志，2004，06:381-383.

［5］中华中医药学会脾胃病分会.消化不良中医诊疗共识意见(2009)［J］.中国中西医结合杂志，2010，30(5):533-537.

［6］Liu LS，Winston JH，Shenoy MM，et al.，A rat model of chronic gastric sensorimotor dysfunction resulting from transient neonatal gastric irritation［J］.Gastroenterology，2008，134，(7):2070-2079.

［7］Suchecki D，Tu fk S.Social stability attenuates the stress in the modified multiple platform method for paradoxical sleep deprivation in the rat［J］.Physiol Behav，2000，68(3):309-316.

［8］Towell A，Muscat R，Willner P.Effects of pimozide on sucrose consumption and preference［J］.Psychopharmacology (Berl)，1987，92(2):262-264.

［9］Strekalova T，Spanagel R，Bartsch D，et al.Stress-induced anhedonia in mice is associated with deficits in forced swimming and exploration［J］.Neuropsychopharmacology 2004，29(11):2007-2017.

［10］Wang X，Zhao T，Qiu Y，et al.Metabonomics approach to understanding acute and chronic stress in rat models［J］.J Proteome Res，2009，8(5):2511-2518.

［11］Liu LS，Shenoy M，Pasricha PJ.The analgesic effects of the GABAB receptor agonist，baclofen，in a rodent model of functional dyspepsia［J］.Neurogastroenterol Motil，2011，23(4):356-361.

［12］Di Stefano M，Miceli E，Tana P，et al.Fasting and postprandial gastric sensorimotor activity in functional dyspepsia:postprandial distress vs.epigastric pain syndrome［J］.Am J Gastroenterol，2014，109(10):1631-1639.

［13］刘晶，李峰，唐旭东，等.功能性消化不良中医辨证及辨证标准的现代临床文献研究［J］.世界中医药，2015，(1):56-59.