马勃状硬皮马勃胞外多糖的分子结构及抗氧化活性研究

何培新，吴双双，贺新生，许春平*

（1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002；2.西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

0 引言

自Chihara 等[1]1969 年发现香菇多糖具有抗肿瘤活性和增强机体免疫功能以来，已经发现200 多种具有抗肿瘤活性的药用真菌多糖[2-3].此外还发现真菌多糖具有降低血糖血脂、抗辐射、抗衰老、保肝护肝、抗氧化等多种生理功能[4]，使其成为国内外医药与保健品行业研究与开发的热点.马勃状硬皮马勃（Scleroderma areolatum Ehrenb），又名马皮泡、灰包，属于担子菌亚门（Basidiomycotina），硬皮马勃目（Sclerodermatales），硬皮马勃科（Sclerodermataceae），硬皮马勃属（Scleroderma）.该属真菌广泛分布于世界各地，共有60 余种，在我国较常见的有11 种.硬皮马勃幼嫩时可食用，并多有止血、消肿、清热和解毒等药用功效[5].马勃状硬皮马勃的子实体水提液具有抑菌、抗炎、止咳、止血、杀虫、抗溃疡等作用[6].该属真菌具有很高的药用价值，其部分化学成分国外已有相关报道[7]，其中一种新的羊毛甾烷型三萜化合物（lanostanetype triterpenoid）对单纯疱疹病毒1 型（HSV-1）有显著的抗病毒活性[8]，然而目前还没有马勃状硬皮马勃胞外多糖（EPS）的研究报道.

本研究对发酵罐制得的马勃状硬皮马勃EPS进行分离纯化、结构表征和抗氧化测定，为进一步研究马勃状硬皮马勃EPS 的构效关系及其在医药行业中的应用奠定了基础.

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

马勃状硬皮马勃试验菌株由野生子实体经组织分离获得，由西南科技大学贺新生教授提供.

1.1.2 发酵罐种子液的制备

用打孔器取平板边缘新生菌丝两块，接入含50 mL 种子培养液的250 mL 锥形瓶中，160 r/min 26 ℃振荡培养4 d.然后加入灭菌磁棒和玻璃珠，置于磁力搅拌器上将菌丝球打碎后备用.本研究所有接种量均固定为4%.

1.1.3 发酵培养条件

采用摇瓶优化的发酵培养基：20.0 g/L 果糖，5.0 g/L 大豆粉，2.5 mmol/L KH2PO4，2.5 mmol/L MgSO4，pH 8.0；发酵培养温度为26 ℃，搅拌速度160 r/min，进气量2 vvm；发酵罐容积为5 L，装液量为3.5 L.

1.1.4 透析袋

采用分子截留量3 500、直径22 mm、压平宽度34 mm 的透析袋.

1.1.5 主要仪器

SW-CJ-2F 超净工作台：苏净安泰；5 L 搅拌式发酵罐：上海百伦科技有限公司；XFH-30CA 立式压力蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；CPA224S 万分之一天平：赛多利斯；78-1SA 磁力搅拌器：上海企戈实业有限公司；CXG-1 电脑恒温层析柜（含DLH-A 恒流泵，DBS-100 全自动部份收集器）：上海青浦沪西仪器厂；SJIA-10N 冷冻干燥机：宁波双嘉仪器有限公司；HZT-A1000 电子天平：上海嘉展仪器设备有限公司；UV-17001C 紫外分光光度计：上海凤凰光学科仪有限公司；Sepharose CL-6B 层析柱：上海索莱宝生物技术公司；日本EYELA 全自动旋转蒸发仪N-2100：东京理化；SHB-III 循环水多用真空泵：北京成萌伟业有限公司；Nicolet 5700 傅立叶变换红外光谱仪：美国；尺寸排阻色谱-多角度激光光散射（SECMALLS）：美国怀亚特.

1.1.6 主要化学试剂

果糖、苯酚、浓硫酸、氯仿、正丁醇、无水乙醇、KH2PO4、MgSO4、NaNO3、NaN3、KBr、吡啶和甲醇等（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；大豆粉购自莲花市场；蓝色葡聚糖2000、标准葡聚糖（Dextran T10、T40、T70、T150）：上海玉博生物科技有限公司；Sepharose CL-6B：Solarbio 公司；三氟乙酸（色谱纯）：阿拉丁试剂有限公司；三甲基氯硅烷（BSTFA∶TMCS，99∶1）（色谱纯）：东京化成工业株式会社产品.

1.2 试验方法

1.2.1 从发酵液提取粗多糖

利用抽滤法[9]分离菌丝体和发酵液，将发酵液旋蒸浓缩至1/3，加入4 倍体积无水乙醇，4 ℃静置过夜，然后10 000 r/min 离心15 min，得到粗多糖沉淀.

1.2.2 sevag 法除蛋白[10]

用少量蒸馏水溶解粗多糖，加入1/3 体积多糖溶液的除蛋白液(氯仿/正丁醇混合液，体积比为5∶1)，磁力搅拌30 min，然后于分液漏斗中静置20 min，除去下层的有机相，保留水相；重复操作4～5次，直至有机相与水相间无明显沉淀为止.将所有水相浓缩3 倍，加入4 倍体积无水乙醇，4 ℃静置过夜后，10 000 r/min 离心15 min，得到粗多糖沉淀.粗多糖沉淀冷冻干燥即得粗胞外多糖.

1.2.3 粗胞外多糖的分离纯化

称量20 mg 粗多糖，溶解于2 mL 0.2 mol/L 的NaCl 溶液，用0.22 μm 孔径的滤膜过滤，再进行Sepharose CL-6B 柱层析.调整恒流泵使洗脱液流速为1.15 mL/min，利用自动收集器收集.从每管取1 mL 收集液，用苯酚硫酸法[11]于490 nm 处检测多糖，于280 nm 处直接检测收集液的蛋白，记录吸光度值.以管数为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制粗多糖纯化曲线.重复过层析柱8～10 次，将同一组分的多糖收集在一起，浓缩后用分子截留量为3 500 的透析袋透析3 d，每天换蒸馏水3 次.最后将透析过的精制胞外多糖冷冻干燥，置干燥器中备用.

1.2.4 凝胶过滤法测胞外多糖的相对分子质量[12]

用0.2 mol/L NaCl 溶液平衡Sepharose CL-6B层析柱24 h 后，先用蓝色葡聚糖2 000 加入柱内测得外水体积V0，然后取2 mL 质量浓度为2 mg/mL 的分子质量不同的标准葡聚糖（Dextran T10、T40、T70、T150）分别相继上样，调整恒流泵使洗脱液流速为1.15 mL/min，利用自动收集器收集.用苯酚硫酸法检测吸光度值，合并洗脱液，分别求得洗脱体积Ve.凝胶柱所能容纳的总体积定为Vt，其计算方法见公式（1）.以各标准多糖的分配系数Kav值为横坐标，以分子质量的对数值为纵坐标作标准曲线.Kav的计算公式见（2）.

式中：D 为层析柱直径，h 为层析柱高，Ve为洗脱体积，V0为外水体积，Vt为柱床总体积.

按上述方法测得真菌胞外多糖的Ve，由标准曲线求得其相对分子质量.

1.2.5 精制EPS 的红外光谱（IR）测定

称取2～3 mg 精制EPS，加入适量的KBr，研磨均匀后压片，用傅立叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1波长区间内扫描红外吸收值[13].

1.2.6 精制EPS 的气相色谱/质谱（GC/MS）测定

称取精制EPS 3 mg，放入棕色小瓶中，加入3 mL 2 mol/L 的三氟乙酸，密封后置于121 ℃的烘箱中恒温2 h.冷却后用0.22 μm 的水相滤膜过滤，滤液旋转蒸干，然后加入2～3 mL 甲醇再次蒸干，重复3 次.加入1.5 mL 吡啶和0.1 mL 衍生试剂BSTFA∶TMCA（99∶1），密封后置于80 ℃的烘箱中恒温1 h，冷却后过0.22 μm 的有机滤膜，送样检测[14].

上样条件：HP-5 MS 60 m 色谱柱，进样量0.1 μL，分流比100∶1，延迟时间7 min，进样口温度280 ℃，传输线温度280 ℃.升温程序为：起始温度60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 的速度升温至280 ℃，保持20 min.MS 分析条件：溶剂延迟7 min，扫描范围35～455 aum，进样口280 ℃，传输线温度280 ℃，EI 能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度160 ℃.

1.2.7 SEC/MALLS 测定精制EPS 的相对分子质量及分子构象

尺寸排阻色谱（SEC）、多角度激光光散射检测器（MALLS）及示差折光检测器（RI）联用可测定精制EPS 相对分子质量的大小及分子构象[15].

使用50 mmol/L NaNO3和0.02% NaN3溶解精制EPS 样品，配制成2 mg/mL 的样品溶液，用0.22 μm 的水相膜过滤后备用.流速0.5 mL/min，进样量100 μL，样品的dn/dc 值根据相关文献设置为0.14 mL/g[16].使用软件Astra 4.72（美国怀亚特技术公司）计算样品的相对分子质量大小和均方根的回转半径.从均方根半径与样品相对分子质量的双对数曲线中，可以判断多糖分子在水溶液中的构象，具体条件由下列公式给出：

式中：ri是样品的均方根半径，Mi是样品的分子质量，k 是均方根半径在Y 轴的截距，1/3、1/2 和1 分别代表样品不同构象的临界坡度值.

1.2.8 精制EPS 黏度的测定[17]

EPS 的黏度用乌氏黏度计在（25±0.1）℃的水浴中进行测定.选择溶剂流出毛细管时间大于120 s 的黏度计，由此可忽略动能校正.用逐步稀释法按以下的Huggins 方程（3）和Kraemer 方程（4），将浓度外推至零计算特性黏度[η]:

其中，k’和β 为多糖在某温度下某溶剂中的常数，ηsp/c 为比浓黏度，lnηr/c 为比浓对数黏度.

1.2.9 精制EPS 均方根旋转半径（Rg）和流体力学半径（Rh）的测定[18]

分子质量中心到各质点（基团）距离平方的平均值的平方根被定义为均方根旋转半径（Rg），它反映单个高分子分子链在空间的伸展程度.流体力学半径（Rh）反映流体力学作用时大分子在溶液中的尺寸，它是一个与高聚物链有相同平移扩散系数的等效球体的半径[19].Rg通过SEC-MALLS 法测得，而Rh通过黏度法获得，根据Einstein 理论公式（5）[20]推算得：

式中：NA为阿伏伽德罗常数（6.022×1023），Mw和[η]分别为重均分子质量和特性黏度.

均方旋转半径和流体力学半径的比值可以用ρ 表示：

1.2.10 邻二氮菲法测定EPS 对·OH 的清除能力[21]

配制质量浓度梯度分别为2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL 的EPS 溶液10 mL.取7 支试管，其中5 支为试验组，1 支作为对照组，1 支为调零组.向试验组中加入1 mL pH 为7.4 的磷酸缓冲液（0.02 mmol/L，PBS），1 mL 7.5 mmol/L的邻二氮菲溶液，1 mL 3.25 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 1.5%H2O2，EPS 溶液2 mL.调零组以蒸馏水代替2 mL EPS 溶液，对照组以蒸馏水代替2 mL EPS 溶液和1 mL 1.5%H2O2.混匀后，于37 ℃恒温1 h.调零组调零后，用紫外分光光度计于510 nm处测定试验组和对照组的吸光度值.每组做3 次平行试验，取其平均值.EPS 对·OH 清除率的计算公式如下：

式中：Ai是试验组的吸光度值，Aj是对照组的吸光度值.

1.2.11 EPS 对·DPPH 清除能力的测定[22]

配制质量浓度梯度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL 的EPS 溶液20 mL.取11 支试管，5 支为试验组，5 支为对照组，1 支为空白组.向试验组分别加入2 mL EPS 溶液、2 mL 0.1 g/L 的DPPH 50%乙醇溶液，混匀后，于25 ℃恒温1 h，以50%乙醇溶液为空白于517 nm 处测定其吸光度Ai；向空白组分别加入2 mL 0.1 g/L的DPPH 50%乙醇溶液、2 mL 蒸馏水，混匀后于25 ℃水浴中放置1 h，于517 nm 处测定其吸光度A0；向对照组分别加入2 mL EPS 溶液、2 mL 50%乙醇，混匀后于25 ℃恒温1 h，于517 nm 处测定其吸光度Aj.EPS 对·DPPH 清除率的计算公式如下：

式中：Ai是试验组的吸光度值，Aj是对照组的吸光度值，A0是空白组的吸光度值.

2 结果与讨论

2.1 马勃状硬皮马勃EPS 的分离纯化

发酵罐发酵马勃状硬皮马勃所产EPS 经除蛋白后，通过Sepharose CL-6B 柱层析进行分离纯化，结果如图1 所示.通过分析可知，马勃状硬皮马勃粗多糖纯化时有两个多糖吸收峰，即两个组分（Fr-I 和Fr-II）.Fr-I 为13～35 管，Fr-II 为36～45 管，对这两个组分的管数分别进行收集，透析袋透析，然后冷冻干燥，即得精制多糖.而且可以看出，蛋白吸收峰在两个多糖吸收峰中都有，说明其精制多糖的两个组分均可能含有蛋白.

图1 马勃状硬皮马勃产EPS 分离纯化结果Fig.1 The separation and purification of EPS from S.areolatum Ehrenb

2.2 马勃状硬皮马勃EPS 的相对分子质量

以Kav为横坐标，葡聚糖标准品系列的logM为纵坐标，绘得分子质量标准曲线，回归方程为y=-5.485 8x+6.537 9，相关性系数为R2=0.999 3.由标准曲线推算得马勃状硬皮马勃EPS 精制组分的相对分子质量，结果如图2 所示.试验测得马勃状硬皮马勃EPSFr-I 和Fr-II 的Ve分别为115 mL 和195 mL，根据标准曲线推算得马勃状硬皮马勃EPS Fr-I 和Fr-II 组分的相对分子质量分别为627 500 和4 820.

2.3 马勃状硬皮马勃EPS 的红外光谱分析

图2 马勃状硬皮马勃EPS 精制组分的相对分子质量Fig.2 The relative molecular weight of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

图3 马勃状硬皮马勃EPS 精制组分的红外光谱Fig.3 The RT-IR spectra of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

马勃状硬皮马勃产EPS Fr-I 和Fr-II 的红外光谱图如图3 所示.通过分析可知，马勃状硬皮马勃EPS Fr-I 在3 299.4 cm-1有宽展圆滑强吸收峰，为O—H 伸缩振动，说明其分子氢键以分子间氢键为主；2 930.4 cm-1处有较强吸收峰是由多糖中甲基—CH3或次甲基—CH2的C—H 的伸缩振动引起的，具有典型的多糖特征；在1 650.8 cm-1处出现红外吸收峰，为N—H 的变角振动，为氨基或酰胺基的结构[23]；1 386.2 cm-1处的红外吸收峰为磺酰基—O—SO2—R 的S ＝O 非对称伸缩振动；1 123.8 cm-1处有红外吸收峰，为C—O—C 环内醚的C—O 伸缩振动；1 020.5 cm-1处的红外吸收峰为—OH 的O—H 变角振动；在970.1 cm-1处出现红外吸收峰，此处为吡喃环末端次甲基的横摇振动；916.9 cm-1处出现红外吸收峰，为α-吡喃糖的特征吸收峰；810.9 cm-1处的红外吸收峰为甘露糖特征吸收峰[24].因此可以推测其Fr-I 可能是α-吡喃型甘露糖苷酸性杂多糖[25].马勃状硬皮马勃EPS Fr-II 与Fr-I 不同的是在1 241.5 cm-1处有吸收峰，说明有酯基或O—乙酰基的存在；没有C—O—C 环内醚的C—O 伸缩振动；经分析可以得出其Fr-II 可能也是α-吡喃型甘露糖苷酸性杂多糖.

2.4 马勃状硬皮马勃EPS 单糖组分分析

将马勃状硬皮马勃EPS 的各精制组分分别进行GC/MS 检测，把各个组分的气相色谱图中每个峰的保留时间与标准单糖的保留时间进行比对.分别对马勃状硬皮马勃EPS 精制组分的气相色谱图进行分析，结果如图4 所示.

采用面积归一化法对马勃状硬皮马勃EPS 单糖组分进行分析，分析结果如表1 所示，其Fr-I 和Fr-II 所含单糖组分和含量分别为：鼠李糖0.86%、1.99%，核糖5.35%、8.36%，木糖9.81%、3.77%，葡萄糖醛酸47.35%、35.05%，半乳糖2.21%、2.82 %，葡萄糖4.21%、7.50%，甘露糖29.70%、33.79 %，半乳糖醛酸0.51%、6.72%，两个组分所含单糖组分的种类一样，含量有所差异.马勃状硬皮马勃EPS各精制组分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，说明发酵所得的EPS 可能为酸性多糖[25-26]，与其红外光谱分析结果一致；其单糖组分中甘露糖的含量较多，与红外光谱中810 cm-1处出现的甘露糖特征吸收峰一致.

图4 马勃状硬皮马勃EPS 精制组分气相色谱图（上：Fr-I，下：Fr-II）Fig.4 The GC of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb（top:Fr-I，under:Fr-II）

2.5 马勃状硬皮马勃EPS 的SEC/MALLS 分析

利用尺寸排阻色谱（SEC）、多角度激光光散射检测器（MALLS）及示差折光检测器（RI）联用技术，可检测马勃状硬皮马勃EPS 精制组分的分子质量及其在水溶液中的分布情况，结果如表2 所示.

分析表2 可知，马勃状硬皮马勃EPS Fr-I 和Fr-II 的重均分子质量分别为1.332×105和1.198×105，Mw/Mn即多分散系数分别为4.797 和2.996，表明两个组分的分散性均很低，在水溶液中很容易形成大量的聚集体，溶解度很小.马勃状硬皮马勃EPSFr-I 和Fr-II 的均方根半径分别为22.0 nm 和12.8 nm，Fr-I 和Fr-II 的均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率分别为0.13 和0.15（图5），说明其在水溶液中以球形构象存在，是一种高度紧密而且具有分支结构的多糖聚集体.通过SEC/MALLS 测得马勃状硬皮马勃产EPSFr-II 的相对分子质量大于凝胶过滤法测得的相对分子质量，这可能是因为精制多糖经过透析时多糖分子发生了聚集，溶解度降低所致.马勃状硬皮马勃产EPS 精制组分Fr-I（左）和Fr-II（右）的均方根半径对相对分子质量的双对数曲线如图5 所示.

表2 马勃状硬皮马勃EPS 精制组分SEC/MALLS 参数Table 2 The SEC/MALLS parameters of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

图5 马勃状硬皮马勃EPS 精制组分均方根半径对分子质量的双对数曲线（上：Fr-I，下：Fr-II）Fig.5 The double logarithmic curve of root mean square radius vs molecular weight for EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb（top:Fr-I，umder:Fr-II）

2.6 马勃状硬皮马勃EPS 的分子构象分析

马勃状硬皮马勃EPS 分子构象的参数如表3所示，其中Mw和Rg值通过SEC-MALLS 法测得，而Rh通过黏度法获得，根据Einstein 理论公式推算得到.黏度由乌氏黏度计测定，它反映了在稀溶液中多糖所占的水力体积.通常认为，黏度越小，多糖往往具有比较致密的构象[27].由表3 可知，试验测得马勃状硬皮马勃EPS Fr-II 的黏度值较Fr-I小，而且其相对分子质量和均方旋转半径均较Fr-I的小，尤其是均方旋转半径非常小，说明其链未舒展开，结构较为致密.

表3 马勃状硬皮马勃EPS 精制组分的分子构象参数Table 3 The molecular conformation parameters of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

k’值在0.3～0.5 之间时，表明该溶液对聚合物是良溶剂.由表3 可知，马勃状硬皮马勃EPS 各精制组分的k’均大于0.5，说明其在水溶液中的溶解性较低.Rg和Rh的比值为ρ，ρ 值可以用来描述多糖分子在水溶液中的链构象，ρ≈0.3 时，为均一紧密的球形构象；ρ≈0.5 时，为一个松散连接的超支化链或聚合物；ρ≈1.0 时，为刚性杆状链.分析结果可知，马勃状硬皮马勃EPS 各精制组分的ρ 值均接近于1，说明其EPS 各精制组分在水溶液中可能为刚性杆状链的多糖聚集体.

2.7 马勃状硬皮马勃EPS 的抗氧化活性分析

马勃状硬皮马勃EPS 对·OH 和·DPPH 自由基的清除率如图6 所示.从图6 可以看出，当马勃状硬皮马勃EPS 质量浓度为10 mg/mL 时，其对·OH自由基的清除率高达22.65%，而当马勃状硬皮马勃EPS 浓度为5 mg/mL 时，其对·DPPH 自由基的清除率已高达41.32%.马勃状硬皮马勃EPS对·DPPH 自由基的清除率明显高于其对·OH 自由基的清除率，表现出良好的抗氧化活性.

图6 马勃状硬皮马勃EPS 对·OH 和·DPPH自由基的清除率Fig.6 The OH and DPPH radical scavenging rate of EPS from S.areolatum Ehrenb

3 结论

本研究表明，马勃状硬皮马勃EPS 含有两个组分Fr-I 和Fr-II，两组分的相对分子质量分别为627 500 和4 820.红外光谱分析可知，其EPS 具有明显的多糖特征吸收峰，可能为α-吡喃型甘露糖苷酸性杂多糖.Fr-I 和Fr-II 单糖组分和含量分别为：鼠李糖0.86%、1.99%，核糖5.35%、8.36%，木糖9.81%、3.77%，葡萄糖醛酸47.35%、35.05%，半乳糖2.21%、2.82%，葡萄糖4.21%、7.50%，甘露糖29.70%、33.79%，半乳糖醛酸0.51%、6.72%，两个组分所含单糖组分的种类一样，但含量有所差异；两种组分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，表明发酵所得EPS 可能为酸性多糖，该结果与红外光谱分析结果一致；单糖组分中甘露糖的含量较多，与红外光谱中810 cm-1处出现的甘露糖特征吸收峰一致.SEC/MALLS 测定结果表明，其EPS 分散性很低，在水溶液中很容易形成大量的聚集体，溶解度很小，且在水溶液中以球形构象存在，是一种高度紧密而且具有分支结构的多糖聚集体.马勃状硬皮马勃EPS Fr-II 的黏度、相对分子质量和均方旋转半径均较Fr-I 的小，尤其是均方旋转半径非常小，说明其链未舒展开，结构较为致密；马勃状硬皮马勃EPS 的ρ 值接近于1，说明其EPS 在水溶液中可能为刚性杆状链的多糖聚集体.马勃状硬皮马勃EPS 质量浓度为10 mg/mL 时，对·OH 自由基的清除率为22.65%，当质量浓度为5 mg/mL 时，对·DPPH 自由基的清除率高达41.32%，表现出良好的抗氧化活性.本研究结果为进一步研究马勃状硬皮马勃EPS 的构效关系及其在医药行业的应用奠定了基础.

［1］Chihara G，Maeda Y，Hamuro J，et al.Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes（Berk.）Sing［J］.Nature，1969，222：687-688.

［2］Reshetnikov S，Wasser S，Tan K.Higher basidiomycota as a source of antitumour and immunostimulating polysaccharides［J］.International Journal of Medicinal Mushrooms，2001，3：361-394.

［3］Cui J，Chisti Y Y.Polysaccharopeptides of coriolus versicolor:physiological activity，uses，and production［J］.Biotechnol Advances，2003，21：109-122.

［4］徐丽萍.真菌多糖的生物活性及分离纯化技术研究进展［J］.生物学教学，2014，39（12）：3-5.

［5］刘波.中国药用真菌［M］.太原：山西人民出版社，1978：272.

［6］卯晓岚.中国经济真菌［M］.北京：科学出版社，1998：613.

［7］Monika W，Alberto G，Helga S，et al.Unusual pulvinic acid dimers from the common fungi Scleroderma citrinum and Chalciporus piperatus［J］.Angewandte Chemie International Edition，2004，43（14）:1883-1886.

［8］Somde J K，Kwanjai K，Thirada P，et al.A bioactive triterpenoid and vulpinic acid derivatives from the mushroom Scleroderma citrinum［J］.Planta Medica，2003，69（6）:568-571.

［9］柯轶，巫文政，毛宁.一株虫草类真菌的液体发酵产胞内多糖培养基的优化［J］.海峡科学，2010（7）:3-5.

［10］Sevag M G.Mechanism of the respiration of pneumococci.II［J］.Biochemical Pharmacology，1934，273:419-429.

［11］Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28（3）:350-356.

［12］陈永，卢戌，谭晓晶，等.红毛五加多糖的分离纯化与分子质量测定［J］.四川大学学报：自然科学版，2005，42（2）:373-376.

［13］Kasperdl W，Tzianabos A.Biological chem istry of immunomodulation by zwitteronic polysaccharides［J］.Carbohydrate Research，2003，338:2531-2542.

［14］林勤保，蒋梅峰，杨春.气相色谱-质谱联用法测定大枣低聚糖的单糖组成［J］.食品科学，2009，30（19）:210-212.

［15］Li Y，Weiss W F，Roberts C J.Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi -angle laser light scattering［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98:3997-4016.

［16］Jumel K，Fiebrig I，Harding S E.Harding rapid size distribution and purity analysis of gastric mucus glycoproteins by size exclusion chrom -atography/multi-angle laser light scattering［J］.International Journal of Biological Macromole -cules，1996，18:133-139.

［17］石磊，韩龙，刘超.多糖的构象研究方法综述［J］.曲阜师范大学学报，2012，38（3）:78-84.

［18］邵丽，吴正钧，吴江，等.鼠李糖乳杆菌胞外多糖S1 的分子特性研究［J］.食品工业科技，2014，11（21）：1-11.

［19］许淑琴.黑木耳刚性链葡聚糖结构、链构象转变及自组装行为［D］.武汉：武汉大学，2013.

［20］Debye P，Bueche A M.Intrinsic viscosity，diffusion，and sedimentation rate of polymers in solution［J］.The Journal of Chemical Physics，1948，16（6）:573-579.

［21］郭甜甜，于桂洪，郭涛，等.红树林根泥真菌Aspergillus versicolor sp.PJX-9 胞外多糖结构特征及抗氧化活性研究［J］.中国海洋药物，2015，34（2）：29-33.

［22］聂少平，谢明勇，罗珍.用清除有机自由基DPPH 法评价茶叶多糖的抗氧化活性［J］.食品科学，2006，27（3）：34-36.

［23］武翠玲，邓永康，孟延发.大马勃水溶性多糖的结构研究［J］.天然产物研究与开发，2008，20（6）:1027-1030.

［24］Volpi N.Milligram-scale preparation and purification of oligosaccharides of defined length possessing the structure of chondroitin from defructosylated capsular polysaccharide K4［J］.Glycobiology，2003，13（9）:635-640.

［25］唐雨薇，张宇，王宇亮，等.黄芪多糖分离与结构特征分析［J］.时珍国医国药，2014，25（5）:1097-1100.

［26］马素云，姚丽芬，叶长文，等.1 种银耳多糖的分离纯化及结构分析［J］.中国食品学报，2013，13（1）:173-177.

［27］Huang Z P，Huang Y N，Li X B，et al.Molecular mass and chain conformations of Rhizoma panacis Japonici polysaccharides［J］.Carbohydrate Polymers，2009，78（3）:596-601.