同步辐射X射线小角散射溶液样品蠕动实验装置的研制

李怡雯，边风刚，洪春霞，赵 镍，杨春明，王 劼

(1.中国科学院 上海应用物理研究所，上海 201204；2.中国科学院大学，北京 100049)

同步辐射X射线小角散射溶液样品蠕动实验装置的研制

李怡雯1,2，边风刚1,*，洪春霞1，赵 镍1,2，杨春明1，王 劼1,*

(1.中国科学院 上海应用物理研究所，上海 201204；2.中国科学院大学，北京 100049)

研制了用于同步辐射X射线小角散射实验的溶液样品蠕动实验装置，其主要特点为可有效抑制X射线对溶液样品的辐射损伤、密封性能好、操作简便，且背景散射低、消耗样品量小，还可根据实验要求实现对样品温度的控制，进行变温原位测量。此外，通过实验对该装置的进样量和蠕动速度进行了标定，对防辐射损伤效果进行了验证。结果表明，该装置控制精度高，并可有效减小X射线在测量过程中对样品的辐射损伤。

同步辐射；X射线小角散射；辐射损伤；蠕动实验装置

小角X射线散射(SAXS)是由于物质内部存在的电子密度起伏从而在偏离入射X射线光束很小的角度范围内引起的散射现象[1]。20世纪50年代前后，开始将SAXS用于获取蛋白质的结构信息[2-3]。在随后的几十年里，随着高通量的同步辐射光束线的建设、相关探测技术的发展及各种计算方法的完善，同步辐射小角散射技术逐渐成为研究蛋白质等生物大分子亚微观结构和形态的一种重要工具。

目前，解析蛋白质结构主要依靠X射线衍射(XRD)、核磁共振(NMR)和冷冻电子显微镜等实验技术。与这些实验技术相比，SAXS几乎不受粒子大小、样品晶体等条件的限制，可对溶液状态(更接近生理状态)下分子质量从kDa到几MDa范围内的样品进行研究，得到其大小、形态等低分辨率三维结构信息。特别地，由于第3代同步辐射光源的强度高、稳定性好等特点，结合先进的探测成像系统，SAXS还可用于蛋白质折叠、去折叠等构象变化的动态研究[4-5]。

SAXS要求用于结构分析的样品具有单分散性，即要求体系中所有的大分子粒子的尺寸和形状必须完全一致。在实验前，可通过动态光散射或分析超速离心验证样品的单分散性。但由于实验中高通量同步辐射光的照射，X射线对蛋白质等生物样品的辐射损伤往往会破坏体系的单分散性。高通量的X射线照射溶液样品时会激发水分子产生羟基或超氧化氢自由基，溶剂中的自由基迅速结合到氨基酸支架以及侧链上(结合常数为109～1010L/mol/s)，与自由基相结合的蛋白彼此间通过共价键及非共价键聚集在一起[6]，导致其二级和三级结构扭曲[7]。在SAXS测量中，蛋白质若受到辐射损伤，最常见的情形是发生集聚。由于小角度内的散射曲线反映的是样品内纳米尺度粒子的大小和形状，所以蛋白的集聚会严重干扰SAXS的测量，即使广角X射线散射(WAXS)也会受到蛋白质辐射损伤的影响[8]。因而，如何减小测量过程中X射线对蛋白质等溶液样品的辐射损伤，获得有效的实验数据，是所有同步辐射线站所面临的共同问题。

减小SAXS生物大分子溶液样品辐射损伤最普遍的方法是在样品中添加乙醇、EDTA、DTT等还原剂来清除辐解自由基[9]，或添加甘油、乙二醇、蔗糖等低温防护剂[10]。但这同时也会给测量带来许多麻烦，如改变了蛋白质的稳定性、增加了溶剂的黏度、减小了溶剂与溶质的散射对比度等。另外，与XRD晶体低温测量法类似，在SAXS中也可通过快速冷却将溶剂玻璃化，低温冷冻的蛋白质、核酸等生物大分子所能承受的辐射剂量是常温下的2倍[11]。但与XRD晶体低温测量不同，溶液快速冷却后溶剂散射信号的增强以及冰微晶的产生等因素均增加了背底扣除的难度。

除添加还原剂、快速冷却等方法，通过改变样品本身来降低辐射损伤外，测量方法与样品池的设计也同样影响蛋白质所受辐射损伤的程度。例如，Hong等[12]设计了一种静态样品池，并采用二维扫描式曝光来降低单位体积内辐解自由基的累积，获得有效的SAXS数据。Lipfert等[13]设计了一种样品池装置，可方便实现溶液样品静态与动态测量模式的切换，在动态模式下，样品依次流过通光口。与静态测量模式相比，流动状态下单位体积样品的曝光时间缩短，所受辐射损伤显著降低。但该装置的样品消耗量大(0.7～1 mL)，且不便于进行温度控制的原位测量。

本文拟研制一种溶液样品蠕动实验装置，以降低同步辐射测量过程中X射线对样品的辐射损伤，减少样品消耗量，并实现对样品温度的控制，进行变温原位测量。

1 装置结构

图1 装置总体结构Fig.1 Overall structure of device

溶液样品蠕动实验装置如图1、2所示。

该溶液样品蠕动实验装置主要包括：底座、控温室、样品室、容器、注射器、侧座及低温恒温槽。其中，控温室顶部设有循环液出入口，通过与低温恒温槽相连将恒温循环液通入控温室中；样品室设于控温室的内部，由依次密封连接的上导管、毛细管和下导管组成；容器与下导管的下端口相连，用于盛放待测溶液样品；注射器与上导管的上端口连接；侧座从控温室的侧壁突出延伸，侧座上设有螺丝孔，以便于将该装置通过侧座固定在同步辐射线站的样品台上，同理，底座上也设置了螺丝孔，用于固定该装置。

图2 装置主体结构主视图(a)和左视图(b)Fig.2 Front view (a) and left view (b) of main part of device

控温室的左、右侧壁上对应于毛细管的高度还分别对称开有通光口，溶液样品在注射器的作用下从容器吸入到毛细管中，达到与通光口对应的高度处时在注射器的作用下来回蠕动。该装置可设定样品蠕动速度(一般设为10～40 μL/s)，由于测试过程中样品持续蠕动，

高通量同步辐射光会照射到样品不同位置，使单位体积样品的曝光时间缩短，因此样品所受辐射损伤降低。该装置采用的石英玻璃毛细管的壁厚为0.01 mm，该毛细管对光束吸收少，背景散射低，有利于弱散射信号溶液样品的测量。此外，控温室样品材料采用导热率较好的铜，通过恒温循环液精确控制样品室的温度(-5～95 ℃)。

该装置使用的低温恒温槽型号为DCY-0506(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，注射器型号为Microlab 600(Hamilton)。该装置进样与蠕动的控制系统软件采用Labview编写，运行在windows系统下，其控制界面如图3所示。当同步辐射实验站光闸开启后，由于实验人员不能近距离操控样品，因此需用该控制软件远程调节注射器上的步进电机驱动丝杠，实现溶液的进样与蠕动。

2 装置标定

计算机远程控制注射器将样品吸入到通光口处的毛细管内，并使其来回蠕动。由于蛋白质等生物样品制备产额低且较为昂贵，该注射器采取μL量级进样，所以有必要对该装置的进样精度进行标定。此外，蠕动速度的大小决定着该装置能否有效防止X射线对样品的辐射损伤，考虑到液体的黏度特性会使注射器设定的蠕动速度与样品溶液实际蠕动速度存在偏差，因而需对装置的蠕动速度进行标定。

图3 蠕动实验装置控制界面Fig.3 Control interface of peristaltic device

2.1 进样量的标定

表1 进样量的标定Table 1 Calibration of sample volume

2.2 蠕动速度的标定

将甘油与去离子水(去离子水的黏度为1 mPa·s)按不同比例混合，配制1组具有黏度梯度的样品溶液，采用如图4所示的光电检测方法测量溶液在毛细管中的蠕动速度，平行测量多次，取平均值。

如图4所示，在石英玻璃毛细管一侧放置He-Ne激光器(25-LHP-213-230，美国CVI Melles Griot公司)，由分束器和反射镜将原光束分成两条平行光束，对面放置光电探测器(PDA 100A，Thorlabs公司)。被测溶液流过毛细管时，光电探测器接收到的光信号强度与没有溶液流过时的明显不同，因此，通过监测示波器(TDS 2024B，Tektronix公司)上两个光电探测器输出端电压信号变化的时间差，即可估算出溶液流经毛细玻璃管a点至b点的平均蠕动速度。

图4 装置蠕动速度的光电检测方法示意图Fig.4 Schematic of photoelectric detection method for peristaltic rate of device

将注射器的蠕动速度分别设定为10、40、80 μL/s，利用图4所示的光电检测方法，测量装置的蠕动速度随溶液黏度的变化，结果如图5所示。流体黏性不仅表现在相邻两层流体作相对运动时有内摩擦作用，而且还表现在流体对固体表面具有粘附作用，即分子之间的内聚力将流体粘附在固体表面，随固体一起运动或静止[14]。因而，在毛细管内，作定常流动的流体其速度剖面是上下对称的抛物线形，如图6所示。当注射泵设置的蠕动速度相同，即体积流量一致时，黏度越大的流体形成的壁面分界层越厚，相应地管轴中心主流区的流动通道变窄，为通过相同的体积流量，在窄截面上的流动速度加快，而本文选用的光电检测方法测得的正是毛细管管轴中心的流速。

图5 装置的蠕动速度随溶液黏度的变化Fig.5 Change of peristaltic rate of device with solution viscosity

图6 毛细管截面上定常流动流体的轴向速度分布[14]Fig.6 Axial velocity distribution of steady flow in cross section of capillary[14]

如图5所示，溶液黏度越接近1 mPa·s，实测蠕动速度越接近注射器设定的蠕动速度，表明毛细管壁附近与管轴中心的速度差越小。通常情况下，SAXS实验选取的蛋白质浓度范围为0.1～20.0 mg/mL，其相对黏度约为1.00～1.10，与去离子水的黏度1 mPa·s较为接近。因而，该浓度范围内样品的实际蠕动速度与设定的蠕动速度基本一致，相对误差小于1.3%。实验所选取的石英玻璃毛细管的内径为(1.98±0.02) mm，由毛细管内径误差所导致的计算后的实测蠕动速度的误差也示于图5。

3 防辐射损伤效果

SAXS实验在上海同步辐射光源(SSRF)小角散射实验站(BL16B)进行。探测器采用的是Mar165CCD，实验选取的入射光波长为0.124 nm，通量约为6.0×1010s-1，样品到探测器的距离为1 993 mm。

实验前，先将溶菌酶蛋白溶于含100 mmol/L NaCl的25 mmol/L Tris-Base、pH=7.6的缓冲溶液中，配成2.5、5、7、9 mg/mL系列浓度的溶液，然后用离心机在4 ℃下以14 000 r/min离心10 min以去除杂质。将溶液样品蠕动装置安装在同步辐射实验台上，调节光路使入射光经过通光口照射到毛细管内的溶液样品上(进样量为60 μL)，散射信号经过真空管道由CCD收集(图7)。分别测量样品曝光前、后溶剂的散射信号，并保持样品与溶剂的曝光时间相同。测量完成后，利用Fit-2D软件[15]将探测器收集的二维散射强度谱转化为散射强度I与散射矢量q的一维曲线，并扣除本底散射，获得目标蛋白的散射信号。对不同浓度样品的散射信号进行归一化处理后发现，其散射曲线的形状保持一致，排除了所选浓度范围内样品形状随浓度变化的可能。

图7 安装于上海同步辐射光源16B线站上的溶液样品蠕动实验装置(a)和CCD收集到的二维散射图(b)Fig.7 Peristaltic device installed on SSRF 16B beamline (a) and 2D scattering profile collected by CCD (b)

为更好地验证该装置的防辐射损伤效果，本实验采取2种曝光模式：1) 样品静止曝光；2) 样品蠕动曝光。通过对比2种曝光模式下样品的散射曲线及回旋半径的变化，进而分析样品受到的辐射损伤程度。图8为浓度为2.5 mg/mL的溶菌酶溶液在静止和蠕动(10 μL/s)2种模式下连续3次曝光100 s所测得的散射曲线。图9为2种模式下溶菌酶散射曲线的Guinier图。由图8a和9a可见，样品在静止模式下，随曝光次数的增加，在低q区的散射曲线出现了上扬，相应地Guinier图斜率变大，溶菌酶蛋白逐渐集聚变性[10]；由图8b和9b可见，样品在蠕动模式下，散射曲线几乎不随曝光次数的增加而变化，低q区的散射曲线重合，相应地Guinier图斜率也几乎不变，样品蛋白未发生明显集聚。静止模式3次曝光测得的溶菌酶回旋半径依次为1.43、1.65、1.76 nm，可见溶菌酶回旋半径随着曝光次数的增加而增大。蠕动模式3次曝光测得的回旋半径依次为1.53、1.59、1.57 nm，可见，在蠕动模式下，溶菌酶回旋半径基本不随曝光次数变化。

图8 2.5 mg/mL溶菌酶溶液在静止(a)与蠕动(b) 2种模式下的散射曲线Fig.8 Solution scattering profiles obtained from 2.5 mg/mL lysozyme using stationary collection mode (a) and peristaltic collection mode (b)

图9 2.5 mg/mL溶菌酶溶液在静止(a)与蠕动(b) 2种模式下测得的散射曲线的Guinier图Fig.9 Guinier plots of scattering profiles from 2.5 mg/mL lysozyme using stationary collection mode (a) and peristaltic collection mode (b)

此外，将5 mg/mL的溶菌酶在2种模式下分别曝光300 s，其散射曲线和Guinier图分别示于图10、11，测得的回旋半径分别为1.67 nm和1.52 nm。将蠕动模式下测得的溶菌酶散射曲线、回旋半径与Bioisis数据库中标准散射曲线(Bioisis ID：LYSOZP)及回旋半径参考值(1.52±0.10) nm相比(图12)，可知该蠕动测量装置不仅可准确获得样品的散射信息，而且还抑制了蛋白质的集聚，达到了很好的防辐射损伤效果。

图10 5 mg/mL溶菌酶溶液的散射曲线及溶菌酶标准曲线Fig.10 Scattering profiles obtained from 5 mg/mL lysozyme and standard curve of lysozyme

图11 5 mg/mL溶菌酶溶液散射曲线的Guinier图Fig.11 Guinier plots of scattering profiles obtained from 5 mg/mL lysozyme

图12 回旋半径随曝光时间的变化Fig.12 Gyration radius vs exposure time

4 结论

介绍了一种用于同步辐射X射线小角散射的溶液样品蠕动实验装置。以溶菌酶散射实验为例，在蠕动和静止2种测量模式下分别测得了溶菌酶的散射曲线和回旋半径。结果表明，利用该装置不仅可准确地获得样品的散射信息，还可有效减小高通量同步辐射光在测量过程中对样品的辐射损伤，特别是对辐射敏感的蛋白质类样品的损伤。

该装置密封性能好，未发生漏液等情况，且操作简便、背景散射低、样品消耗量小、控制精度高，满足微量测量的实验需求。此外，该装置也可实现对样品温度的控制，进行变温原位测量。经实验验证，该装置满足同步辐射X射线小角散射实验要求，可用于蛋白质等辐射敏感溶液样品的相关研究。

[1] GUINIER A, FOURNET G, WALKER C B, et al. Small-angle scattering of X-ray[M]. New York: John Wiley & Sons Inc., 1955.

[2] KRATKY O. Low-angle scattering in polymers[J]. J Polymer Science, 1948, 3: 195-215.

[3] RITLAND H N, KAESBERG P, BEEMAN W W. An X-ray investigation of the shapes and hydrations of several protein molecules in solution[J]. J Chem Phys, 1950, 18: 1 237-1 242.

[4] KATHURIA S V, GUO L, GRACEFFA R, et al. Minireview: Structural insight into early folding events using continuous-flow time-resolved small-angle X-ray scattering[J]. Biopolymers, 2011, 95: 550-558.

[5] ARAI M, ITO K, INOBE T, et al. Fast compaction of alpha-lactalbumin during folding studied by stopped-flow X-ray scattering[J]. J Mol Biol, 2002, 321: 121-132.

[6] GARRISON W M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins[J]. Chem Rev, 1987, 87: 381-398.

[7] DAVIES K J A, DELSIGNORE M E. Protein damage and degradation by oxygen radicals, Ⅲ: Modification of secondary structure and tertiary structure[J]. Biol Chem, 1987, 262: 9 908-9 913.

[8] FISCHETTI R F, RODI D J, MIRZA A, et al. High-resolution wide-angle X-ray scattering of protein solutions: Effect of beam dose on protein integrity[J]. J Synchrotron Rad, 2003, 10: 398-404.

[9] MALEKNIA S D, RALSTON C Y, BRENOWITZ M D, et al. Determination of macromolecular folding and structure by synchrotron X-ray radiolysis techniques[J]. Anal Biochem, 2001, 289: 103-115.

[10]KUWAMOTO S, AKIYAMA S, FUJISAWA T. Radiation damage to a protein solution, detected by synchrotron X-ray small-angle scattering: Dose-related considerations and suppression by cryoprotectants[J]. J Synchrotron Rad, 2004, 11: 462-468.

[11]MEISBURGER S P, WARKENTIN M, CHEN H M, et al. Breaking the radiation damage limit with cryo-SAXS[J]. Biophysical J, 2013, 104: 227-236.

[12]HONG Xinguo, HAO Quan. Measurements of accurate X-ray scattering data of protein solutions using small stationary sample cells[J]. Rev Sci Instrum, 2009, 80: 014303.

[13]LIPFERT J, MILLETT I S, SEIFERT S, et al. Sample holder for small-angle X-ray scattering static and flow cell measurements[J]. Rev Sci Instrum, 2006, 77: 046108.

[14]丁祖荣. 流体力学[M]. 北京:高等教育出版社,2003.

[15]HAMMERSLEY A P, SVENSSON S O, HANFLAND M, et al. Two-dimensional detector software: From real detector to idealized image or two-theta scan[J]. High Press Res, 1996, 14: 235-248.

Development of Peristaltic Device for Solution Sample Measurement by Synchrotron Radiation Small-angle X-ray Scattering

LI Yi-wen1,2, BIAN Feng-gang1,*, HONG Chun-xia1, ZHAO Nie1,2,YANG Chun-ming1, WANG Jie1,*

(1.ShanghaiInstituteofAppliedPhysics,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201204,China;2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

A peristaltic device for solution sample measurement applied in small-angle X-ray scattering at synchrotron radiation was developed. The radiation damage can be efficiently restrained by using this device whose features are good sealing, easy operation, low background scattering, small sample consumption, and the sample temperature can be controlled for in-situ measurement. The sample volume and peristaltic rate of the device were calibrated, and the validity of reducing radiation damage was also verified. The results indicate that this peristaltic device is an effective tool for precise X-ray scattering measurements with high control accuracy.

synchrotron radiation; small-angle X-ray scattering; radiation damage; peristaltic device

2014-03-27;

2014-05-20

973计划资助项目(2011CB911104)

李怡雯(1988—)，女(蒙古族)，黑龙江齐齐哈尔人，博士研究生，核技术及应用专业

*通信作者：边风刚，E-mail: bianfenggang@sinap.ac.cn；王 劼，E-mail: wangjie@sinap.ac.cn

O722.5

A

1000-6931(2015)10-1914-07

10.7538/yzk.2015.49.10.1914