猪屠宰后正常肉与PSE肉中整联蛋白变化与持水性的相关性

吴 霜,陈 韬,张冬怡,刘 劭,马 宁

(云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201)

猪屠宰后正常肉与PSE肉中整联蛋白变化与持水性的相关性

吴 霜,陈 韬*,张冬怡,刘 劭,马 宁

(云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201)

采用蛋白印迹(Western blot)和组织学微观测量技术测定猪宰后正常肉和PSE肉(Pale,Soft,Exudative)中整联蛋白(integrin)降解情况和肌肉组织微观结构变化,并分析integrin对肌肉持水性的影响。结果显示:integrin在宰后逐步降解,正常肉和PSE(Pale,Soft,Exudative)肉样integrin的降解量差异不显著(p>0.05)。同组内比较,正常组在宰后第24 h出现明显降解(p<0.05);PSE组在宰后6 h出现显著降解(p<0.05)。宰后2 d的integrin完整度与汁液流失率呈显著负相关(p<0.05),宰后两组肉样的肌肉细胞间隙面积呈显著性增加(p<0.05),PSE组细胞间隙显著高于正常组的细胞间隙面积。宰后猪肉样品在宰后1、6、24 h的细胞间隙面积与汁液流失率呈极显著正相关(p<0.01)。实验结果表明:宰后integrin降解越少,细胞间隙面积越小,汁液流失率越小,肌肉持水力越强。

猪肉,持水性,整联蛋白,细胞间隙,相关性

猪肉在屠宰后保持水分的能力称为持水性(WHC,water holding capacity)。过高的汁液流失会导致持水性变低,造成较大的经济损失。很多复杂的因素如基因、击晕方法、年龄、冷却速率甚至蛋白质的氧化都会影响肉类的持水性[1-5]。

一些研究指出整联蛋白integrin的降解会影响宰后汁液流失[6-8]。integrin,亚基分子量为88 ku,由α和β亚基所组成[9-10]。integrin将细胞外基质同细胞内的骨架网络连成一个整体[11]。如果在僵直开始后integrin不降解,肌原纤维之间的水分可能流入到肌细胞周围的结缔组织中,在结缔组织良好的持水性性能作用下,水分滞留在结缔组织中[12-13];宰后僵直收缩过程中肌原纤维之间挤出的水分可能进入肌原纤维和细胞膜之间的通道中,所以肌原纤维网格结构收缩导致汁液流失。

已有研究的不足主要表现在并没有研究正常肉与PSE肉中integrin完整度变化的差异性。基于此,本文研究两种肉样的integrin变化与持水性的关系,同时运用肌肉组织形态学来观察肌肉组织微观结构变化,直观地得出细胞间隙与持水性的关系,旨在进一步为猪肉持水性的形成机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

在云南省曲靖市东恒经贸集团食品有限公司取样,选择饲养条件相同的大河乌猪。依据Warner等[14]的标准(PSE:L*>50,滴水损失DL>5%,pH<6.0;正常:L*=42～50,DL<5%,pH<6.0)确定10个正常肉样和8个PSE肉样。在4 ℃的条件下测定样品滴水损失率,并于各时间点(1,6,24 h,2,3,5 d)分别取样,用锡箔纸包裹后于-20 ℃冻藏保存,用于蛋白质印迹分析(western blot)。

HC-3018R 台式高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司;T25-Basc 高速匀浆机 德国艾卡公司;BioRad PowerPac 通用电泳仪电源 伯乐生命医学有限公司;BioRad 小型垂直电泳系统 伯乐生命医学有限公司;BioRad 槽式转印系统 伯乐生命医学有限公司;全自动酶标仪 北京普朗新技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 持水性的测定 参照Honikel的方法[15]测定汁液流失率(DL),修改方法如下:于宰后24 h切取背最长肌,修成长×宽×高为5 cm×3 cm×2 cm的肉条,用万分之一天平称初重W1。用铁丝钩住肉条的一端,保持肌纤维垂直向下,装在聚乙烯薄膜袋中(肉样不能和薄膜袋接触),扎紧袋口后悬挂于铁架车上,置于冷库中,在4 ℃条件下吊挂48 h,取出称重W2。DL计算如下:

1.2.2 全肌肉蛋白的提取 参照Huff-Lonergan等[16]的方法。称取0.2g切碎的背最长肌肉样,加入25 ℃ 5mL全肌肉蛋白提取液(0.01 mol/L磷酸钠(pH7.0),2% 十二烷基硫酸钠(SDS)(w/v)),匀浆30 s(≤10000 r/min,)后,在20 ℃、离心力1500×g条件下离心15 min,用2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠法(BCA)测定上清液浓度,然后用去离子水调蛋白浓度为6.4 mg/mL。取1 mL调整好的蛋白质上清液与0.5 mL上样缓冲液(0.03 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl),0.003 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA),3% SDS溶液,30%甘油,1%溴酚蓝1 mL,pH8.0)混合后加入0.1 mLβ-巯基乙醇。所得样品溶液于50 ℃水浴锅中加热20 min,然后冷却在-20 ℃下贮存备用。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 参照Huff-Lonergan等[16]的方法。电泳凝胶使用5%的浓缩胶和10%的分离胶,制胶厚度0.75 mm。从左至右依次加入预染的标样对照(Marker)5 μL、标准蛋白(Magic mark)5 μL、内部标准蛋白样品(R10-1 h),各时间点蛋白样品(integrin上样量100 μg)。样品通过浓缩胶时设定电压60 V,待样品进入分离胶调电压为120 V。

1.2.4 蛋白质印迹(Western-Blot) 参照Huff-Lonergan等[16]的方法。电泳结束后,在-1 ℃、90 V条件下于转印缓冲液(0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸,0.002 mol/L EDTA和15%(v/v)甲醇)中转印1.5 h。转印后,将转印膜放置于用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)稀释的5%脱脂奶粉封闭液中,室温在摇床上缓慢摇动1h。封闭结束后取出转印膜置于含有20mL用封闭液稀释的一抗(Anti-Integrin β1D Antibody,C-terminus cytoplasmic domain,clone 2B1,MAB1900,Merck Millipore)中,封口,4 ℃摇床上缓慢摇动过夜。一抗孵育过夜后,integrin在室温下用PBST洗膜3次,每次10 min。在室温下将洗过的膜置于20 mL用封闭液稀释的二抗(HRP-Goat Anti-mouse conjugated horseradish peroxidase,Catalog NO.SA00001-1,proteintech)中封闭1h。integrin在室温下用PBST洗膜3次,每次10 min。使用化学发光增强试剂盒(EZ-ECL PLUS Kit HRP,Catalog NO.20-500-120,Bioind)和胶片机来识别目标蛋白表达信号。形成胶片后将转印膜置于PBST中洗三次,每次10 min。将洗好的转印膜置于20 mL用封闭液稀释的β-actin(ACTB Monoclonal Antibody,抗体,Proteintech)中,封口,4 ℃摇床上缓慢摇动过夜。β-actin孵育完成后,integrin在室温下用PBST洗膜3次,每次10 min。在室温下将洗过的膜置于20 mL用封闭液稀释的二抗中孵育1 h。integrin在室温下用PBST洗膜3次,每次10 min。使用化学发光增强试剂盒(EZ-ECL PLUS Kit HRP,Catalog NO.20-500-120,Bioind)和胶片冲洗机来识别目标蛋白表达信号并用imageJ软件分析蛋白条带的光密度值。

1.2.5 肌肉组织形态学分析 参照Gerald[17]的方法。于宰后1、6、24 h取样,每次横切约0.5～1 cm3的小块,置于10%的中性磷酸甲醛缓冲液中(pH7.2,液体的温度同样品的温度相同)固定1 d。将样品的厚度修整到0.5 cm继续放入缓冲液中,在室温条件下进一步固定。将冲洗24 h后的肌肉组织样品在酒精浓度梯度升高的情况下脱水透明,并用固体石蜡包埋。再用切片机切成4 μm的切片,用苏木精-伊红染色技术染色。用 Image-Pro Plus 5.1测得肌束中肌细胞外空隙面积占肌束面积的百分比。

1.3 数据处理与统计分析

使用Microsoft Excel2007计算数值,并使用统计分析软件SPSS 19进行单因素方差分析及Pearson相关分析。

2 结果与分析

2.1 正常与PSE肉的汁液流失率

正常肉的汁液流失率是1.70%,PSE肉宰后肉样汁液流失率是6.86%,二者存在显著差异(p<0.05)。正常肉汁液流失率比PSE肉汁液流失率低75.22%。

2.2 integrin的蛋白印迹结果

如图2所示,宰后两组肉样的integrin随时间的延长而发生降解,PSE肉样组integrin降解多于正常肉样组。如图1所示,正常组integrin的降解量与PSE组integrin的降解量之间不存在显著差异(p>0.05);正常组在宰后1～24 h间integrin未出现明显降解(p>0.05),在宰后24 h出现明显降解(p<0.05);PSE组在宰后6～24 h出现显著降解(p<0.05)。

图1 正常肉样组与PSE肉样组在宰后各时间点integrin的降解Fig.1 Degradation of integrin in normal and PSE during postmortem注:同组肉样内含相同字母差异不显著(p>0.05),含不同字母差异显著(p<0.05),不表示两组肉样间的差异性;整联蛋白完整度:宰后各时间点整联蛋白含量。

图2 正常肉与PSE肉integrin Western blot图Fig.2 Western blot patterns of integrin in normal and PSE group注:M:Magic Mark;Reference sample:内部标准品。

2.3 integrin的完整度与汁液流失率的相关性

如表1所示,宰后猪肉样品1～24 h、3～5 d的integrin的完整度与汁液流失率间无显著相关性,宰后24 h后猪肉样品的integrin的完整度与汁液流失率间呈负相关性,且2 d时间点integrin的完整度与汁液流失率间呈显著负相关(p<0.05),说明宰后24 h后,integrin的降解会降低肌肉的持水性,这与Zhang W G.等[18]研究出在每一个时间点上integrin的完整程度与汁液流失始终呈现负相关性,即integrin降解越多,汁液流失越多的结论基本一致。

表1 宰后integrin的完整度与汁液流失率相关性(N=18)

注:*p<0.05;**p<0.01,表2同。

2.4 肌肉组织形态学的变化

2.4.1 肌束内肌细胞间空间面积的变化 如图3示,宰后两组肉样的肌肉细胞间隙面积都随时间的增加而呈显著性增加(p<0.05),且PSE组细胞间隙显著高于正常组的细胞间隙面积(p<0.05)。其中,正常组宰后6～24 h的细胞间隙显著性增加(p<0.05);PSE组宰后1～6 h样品的细胞间隙面积呈显著性增加(p<0.05)。

图3 宰后肌肉细胞间空隙面积比率变化Fig.3 Changes of extracellular area during postmortem for 1,6 h and 24 h注:a、b表示同组内含相同字母差异不显著(p>0.05),含不同字母差异显著(p<0.05);*表示不同组的同一时间点之间差异显著(p<0.05)。

图4～图6为宰后各时间点(1、6、24 h)正常组样品和PSE组样品肌肉细胞间隙面积差异性的比较，可以看出PSE组肌肉细胞间隙面积明显大于正常组。

图4 宰后1 h肌肉组织结构变化Fig.4 Change of muscular structure at 1 h postmortem注:左为正常组,右为PSE组,图片为50倍放大图。图5、图6同。

图5 宰后6 h肌肉组织结构变化Fig.5 Change of muscular structure at 6 h postmortem

图6 宰后24 h肌肉组织结构变化Fig.6 Change of muscular structure at 24 h postmortem

2.4.2 细胞间隙面积与汁液流失率的相关性 如表2所示,宰后猪肉样品在宰后1、6、24h的细胞间隙面积与汁液流失率呈极显著正相关(p<0.01)。Lawson等[9]观察到宰后流失通道的形成不是在结缔组织和肌纤维之间分开的地方,而是在肌细胞膜和肌纤维分开的位置,认为宰后僵直收缩过程中肌原纤维之间挤出的水分可能进入肌原纤维和细胞膜之间的通道中,而钙激活酶的作用导致整连蛋白的降解和肌原纤维网格结构收缩是形成该流失通道和汁液流失的决定因素。Schafer[8]等认为细胞外间隙和汁液流失有较好的相关性。本实验中,宰后正常肉样与PSE肉样的细胞间隙面积都随贮藏时间的延长而增大,但PSE组细胞间隙面积始终显著大于正常组(p<0.05);宰后细胞间隙面积与汁液流失率呈极显著正相关(p<0.05),说明细胞间隙面积越大,汁液流失率越高。

表2 宰后细胞间隙面积与汁液流失率的相关性(N=18)

2.4.3 细胞间隙面积与integrin完整度的相关性 如表3所示,宰后猪肉样品在宰后24 h的integrin完整度与宰后1 h的细胞间间隙面积呈显著负相关(p<0.05);宰后2 d的integrin完整度与宰后1,24 h的细胞间间隙面积呈极显著负相关(p<0.01);宰后3 d的integrin完整度与宰后6 h的细胞间间隙面积呈显著负相关(p<0.05),说明integrin的降解越多,细胞间隙越大。

3 结论

宰后两组肉样的integrin都随着贮藏时间的推移而降解,正常肉样中integrin的降解小于PSE肉。宰后24 h后,integrin的完整度与汁液流失率呈负相关。宰后两组肉样的肌肉细胞间隙面积都随时间的增加而显著性增大,且PSE组细胞间隙显著大于正常组的细胞间隙面积。宰后integrin的完整度与细胞间隙面积率呈负相关性。这说明宰后integrin的降解速度和降解程度与细胞间隙面积及肉的持水性有关,它们的降解会促进细胞间隙过早过大地形成,从而降低肉的持水性。

表3 细胞间隙面积与宰后integrin的完整度的相关性(N=18)

注:*p<0.05;**p<0.01,表中数据为同行间比较。

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Study on the relationship between the changes of integrin and water holding capacity of PSE and normal pork during postmortem

WU Shuang,CHEN Tao*,ZHANG Dong-yi,LIU Shao,MA Ning

(College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

The relationship between drip loss and the degradation of integrin of normal and PSE pork at post-mortem were analyzed by western blots and histological microscopic measurement techniques. The results showed that integrin both in normal and PSE(Pale,Soft,Exudative)meat were degraded gradually with the extension of time during postmortem,and there was no significant difference in the quantities of degradation between normal and PSE meat(p>0.05). The degradation of integrin of normal pork was significant at 24 h during postmortem(p<0.05). The degradation of integrin of PSE pork was significant at 6 h during postmortem(p<0.05). The integrity of integrin and drip loss was negatively correlated at 2 d during postmortem(p<0.05).The area of muscle cell gap were increased both in normal and PSE pork during postmortem. The gap area showed a significant increase at 1,6,24 h during postmortem,and the gap area of PSE pork was significantly higher than normal pork. Also the cell gap area at 1,6,24 h were positively correlated with the drip loss during postmortem(p<0.01). The experimental results showed that the less the degradation of integrin,the smaller the cell gap area and the drip loss,also stronger the muscle water holding capacity.

pork;water holding capacity;integrin;extracellular area;relevance

2014-12-09

吴霜(1989-)，男，硕士研究生，主要从事畜产品加工与品质控制研究，E-mail:wushuangcn@163.com。

*通讯作者:陈韬(1963-)，男，博士，教授，主要从事肉品质控制和畜产品加工研究，E-mail:chentao63@163.com。

国家自然科学基金(31171711)资助。

TS251

B

1002-0306(2015)21-0064-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.004